新型噬菌体展示载体pCANTAB5S的构建

目的进一步改造噬菌体展示载体,使之能更有效地展示各种外源随机多肽文库.方法以pCANTAB5X-IFN-α2b重组质粒为模板,在上游引物中引入Xba Ⅰ、Sac Ⅰ酶切位点,在下游引物中引入Sac Ⅰ、Stu Ⅰ、Sal Ⅰ酶切位点,将用该引物扩增的IFN-α2b衔接片段PCR产物克隆到pMD18-T中,再将该片段用Xba Ⅰ和Sal Ⅰ酶切并将之插入pCANTAB5L的Xba Ⅰ和Sal Ⅰ位点中,经Sac Ⅰ酶切,线性载体片段自连,构成新型噬菌体展示载体pCANTAB5S.结果限制酶切位点SacⅠ被引入到噬菌体展示载体,并校正了pCANTAB5L载体Stu Ⅰ、Sal Ⅰ等位点的读框.结论成功构建了含读框正确的SacⅠ等多个克隆位点的新型噬菌体展示载体pCANTAB5S,可用于各种外源随机多肽文库的有效展示.     

IL-6体外对PC12细胞株DA和NE代谢抑制的机制

目的:体外研究IL-6与PC12细胞株神经递质DA, NE合成代谢之间的关系及JAK-STATs途径在其中的作用.方法:用不同剂量的IL-6(0.5 mg/L, 1 mg/L和1.5 mg/L)处理分化的PC12细胞, 采用磷脂酰丝氨酸外翻法检测细胞凋亡率, 应用HPLC检测上清和细胞裂解液中DA和NE的含量. 采用1 mg/L IL-6处理分化的PC12细胞, 用免疫印迹法(Western blotting)检测IL-6处理不同时间内全细胞裂解液中STAT3、TH蛋白表达水平, 浆蛋白及核蛋白裂解液内STAT3和p-STAT3表达水平.结果: 各组细胞凋亡率无明显差别. 加入IL-6后, 随着浓度的增加, DA和NE代谢呈近似剂量依赖性降低, 当IL-6为1 mg/L时DA和NE的变化有统计学意义. 1 mg/L IL-6可以增加STAT3蛋白的表达、p-STAT3蛋白的转核、降低酪氨酸强化酶的表达. 结论:IL-6通过JAK-STAT3信号转导途径, 影响酪氨酸羟化酶的表达, 从而降低DA和NE的合成.     

噬菌体展示免疫球蛋白结合分子单结构域随机组合文库的构建

目的:观察和评价转染血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)基因的自体骨髓基质细胞移植于猪的慢性缺血模型后对心功能的保护和促血管新生作用.方法:置Ameriod环建立慢性心肌缺血猪模型,随机分为4组:转染VEGF基因的自体骨髓基质细胞组(组Ⅰ,n=9),单纯细胞移植组(组Ⅱ,n=8),单纯基因治疗组(组Ⅲ,n=7),以注射空腺病毒载体的实验动物为对照组(组Ⅳ,n=8).体外培养自体骨髓基质细胞,Ad.VEGF转染细胞,以CM-DiI为标记,移植于该模型猪心脏的缺血区域.观察和分析各实验组Rentrop分数、心脏射血分数(EF)、梗死区的面积百分比、移植细胞成活性、血管密度及VEGF的表达和分泌.结果:模型建成后,所有动物的冠脉造影左旋支(LCx)完全闭塞或闭塞程度大于95%,说明模型构建成功.与其他各组比较,组Ⅰ的Rentrop分数的升高值及心脏射血分数的升高值均有显著性提高(P＜0.01),梗死区面积明显减少(P＜0.01),具有维持心脏正常功能的几何构型及室壁厚度,且荧光显微镜下可见大量CM-DiI标记的移植成活细胞.组Ⅰ、组Ⅲ缺血区血管计数和VEGF在心肌中的蛋白表达高于组Ⅱ、组Ⅳ,组Ⅰ和组Ⅲ组间并无明显差异.结论:携带VEGF基因的自体骨髓基质细胞移植治疗缺血性心脏病具有明显的优越性,移植细胞成活率高,局部血液循环和心功能改善明显.     

新型噬菌粒展示载体pCANTAB5L的构建

目的：将柔性多肽接头和多克隆位点引入噬菌粒载体pCANTAB5X中，构建适用于展示各种随机肽库、功能靶蛋白、功能靶蛋白变异体库和大分子量（＞300个氨基酸）功能蛋白的新型噬菌粒展示载体。方法：应用5′端含XbaⅠ、StuⅠ、SalⅠ、KpnⅠ识别序列的引物，PCR扩增获得XbaⅠ－StuⅠ-SalⅠ-KpnⅠ－[G4S]3-NotⅠ衔接片段，将该PCR产物克隆到pMD-18T中，再将该片段插入pCANTAB5X中构建成新型噬菌粒展示载体pCANTAB5L。结果：限制性内切酶酶谱及DNA序列分析证明[G4S]3多肽接头和限制性内酶切位点XbaⅠ、StuⅠ、SalⅠ、KpnⅠ序列被引入到新构建的噬菌粒载体pCANTAB5L中。结论：成功构建了新型噬菌粒展示载体pCANTAB5L，并能有效展示功能靶蛋白、功能靶蛋白变异体库和大分子量功能蛋白。     

细胞因子基因佐剂对抗结核杆菌热休克蛋白65的DNA接种的影响

DNA疫苗能诱导体液免疫和强烈的细胞免疫。细胞因子似在效应T细胞亚群产生及确定对DNA疫苗的应答程度中起关键作用。作者以结核杆菌热休克蛋白65(Hsp65)作为模型抗原，比较了几种不同的Th1型细胞因子基因作为DNA疫苗佐剂的效果。     

重组大肠杆菌高密度培养的进展

重组大肠杆菌高密度培养是增加重组蛋白产率的最有效方法。选择最佳的表达系统以及培养基和培养方式是获得高密度和高表达的重组大肠杆菌的有效途径。在培养过程中，通过控制副产物、ｐＨ、温度和诱导时机以及补料方式等参数则能有效地限定比生长速率，从而有利于获得最高的密度和最好的表达。文章从这几方面对近期的研究成果和未来的发展趋势进行了综述。     

腺病毒介导mIFN-β基因转染的小鼠黑色素瘤细胞的体外生物学特性

目的研究腺病毒(Ad)介导mIFN-β基因转染的B16小鼠黑色素瘤细胞的体外生物学特性.方法用Ad为载体将mIFN-β基因导入B16细胞,观察mIFN-β基因转染的B16细胞的体外增殖能力及免疫原性的改变.结果当MOI为50～100,即可获得较高的转染效率,达90%±1%,转染细胞能表达分泌mIFN-β并具有生物学活性;AdmIFN-β感染对B16细胞的增殖能力无影响,但能显著提高细胞表面MHC-Ⅰ类抗原的表达.结论 Ad载体具有较高的转移效率,并能使其携带的mIFN-β基因有效表达;AdmIFN-β转染的B16细胞的免疫原性显著增强.提示利用Ad载体携带有效的目的基因来治疗肿瘤甚至开发瘤苗是可行的.