乙肝表面抗原-CD40L胞外段融合蛋白的设计和生物活性预测

目的：探讨乙肝表面抗原-CD40L胞外段融合蛋白设计的合理性。方法：应用Gene Constructionkit2．5、DNAStar软件和WWW．expasy．org网站提供的分析方案分析重组体的开放读框以及融合蛋白的柔性、亲水性、抗原性、表位等性质，并作了二级结构模拟分析。结果：重组体CMV启动子下游有完整的目的基因ORF，融合蛋白二级结构水平未出现新的抗原性及表位，亲水性无改变，Linker部位抗原性低，呈中性且柔性高，不影响两端的蛋白质二级结构及融合蛋白空间构象。结论：重组体设计合理，融合蛋白很大可能保留了乙肝表面抗原和CD40L胞外段的生物学活性，为进一步研究提供了理论依据。     

HBeAg对小鼠骨髓源性树突状细胞表型及功能的影响

目的 研究HBeAg对小鼠骨髓源性树突状细胞(dendritic cell,DC)表型及功能的影响。 方法 以rmGM-CSF和rmIL-4定向体外诱导C57BL/6小鼠骨髓细胞分化成未成熟DC,随机分为空白对照组、HBeAg刺激组、脂多糖(LPS)刺激组和HBeAg+LPS刺激组。以流式细胞术检测DC表型变化,混合淋巴反应(MLR)检测DC促T淋巴细胞增殖能力,酶联免疫法(ELISA)检测细胞上清液中IL-12的分泌水平,CCK-8法检测HBeAg对骨髓源性树突状细胞活力影响。 结果 HBeAg刺激后,CD11c阳性细胞百分数下降。 HBeAg可抑制DC表面MHC-Ⅱ、CD86的表达和DC促淋巴细胞增殖的能力,且HBeAg可抑制LPS诱导的树突状细胞IL-12的分泌,细胞活力检测显示HBeAg对细胞没有明显毒性作用。 结论 HBeAg对树突状细胞的成熟有一定的负性调节作用,这可能是HBV的持续感染的机制之一。     

HBeAg对小鼠骨髓源性树突状细胞细胞因子分泌及其PI3K-Akt信号通路的影响

目的:探讨乙型肝炎e抗原(HBe Ag)对小鼠骨髓源性树突状细胞(DCs)细胞因子分泌及其PI3KAkt信号通路的影响。方法:分离C57BL/6小鼠骨髓细胞,体外诱导为未成熟树突状细胞(DCs),经CD11c磁珠分选纯化并用LPS刺激成熟后,分成3组:空白组、OVA组和HBe Ag组。经酶联免疫吸附(ELISA)法检测各组培养上清中IL-12p70和IL-10的分泌,用混合淋巴细胞反应(MLR)和Westernblot法分别检测各组DCs刺激T淋巴细胞增殖能力以及细胞内Akt磷酸化水平。结果:HBe Ag组上清液中IL-12p70分泌水平以及DCs刺激T淋巴细胞增殖能力较空白组和OVA组明显降低(P<0.05),而IL-10分泌水平及DCs细胞内Akt的磷酸化水平较其余2组明显升高,差异均具统计学意义(P<0.05)。结论:HBe Ag能够减弱DCs的免疫功能,抑制后者分泌IL-12的同时,增加IL-10的分泌。这些改变可能与PI3K-Akt信号通路的激活有关。     

HBVS-ecdCD40L融合基因构建及相应融合蛋白的二级结构预测

目的构建HBVS—ecdCD40L融合基因,并利用软件对其相应融合蛋白的二级结构进行预测。方法利用分子生物学技术将HBVS基因与人CD40L胞外段基因进行融合,构建融合基因及其真核表达载体,并利用蛋白质分析软件对相应融合蛋白二级结构水平的一些生物学特性进行预测。结果融合基因序列与设计一致,其相应氨基酸序列经软件分析,并与HBsAg和CD40L胞外段氨基酸序列分析结果比较,发现在二级结构上几乎无变化,亲水性和抗原性等生物学活性几乎未受影响。结论HBVS-ecdCD40L融合基因构建成功,软件分析表明融合过程未影响HBsAg和人CD40L胞外段的生物学活性,为进一步研究奠定基础。     

乙型肝炎病毒基因变异研究现状

乙型肝炎病毒(hepatitis B virus,HBV)在其复制过程中,可以发生基因变异.变异的发生与HBV本身的分子生物学特性、宿主的免疫压力、抗病毒药物的应用等因素有关,变异的发生及后果是病毒与宿主相互作用的结果.HBV的S、P、C、X基因都可以发生变异,变异可产生免疫逃逸株、耐药株等,还可影响病毒感染者的预后.现将乙肝病毒基因变异研究现状做一综述.     

HBcAg和HBeAg对小鼠骨髓源性树突状细胞功能的影响

目的 探讨HBcAg和HBeAg对小鼠骨髓源性树突状细胞功能的影响.方法 分离C57BL/6小鼠骨髓细胞,用rmGM-CSF和rmIL-4体外诱导为树突状细胞(DCs)后,按照干预条件分为对照组、HBcAg组和HBeAg组.混合淋巴细胞反应(MLR)检测DCs刺激T淋巴细胞增殖能力,酶联免疫法(ELISA)检测培养上清中IL-12、IL-10和IDO的分泌水平, Western blot法检测Akt 磷酸化水平,设置LY294002组为阳性对照探讨细胞因子分泌的可能调节机制.结果 HBcAg组上清液中IL-12水平以及DCs刺激淋巴细胞增殖能力较对照组明显升高(P<0.01).HBeAg组上清液中IL-12水平以及DCs刺激淋巴细胞增殖能力较对照组明显降低(P<0.05),而IL-10和IDO的水平较对照组明显升高(P<0.01).HBeAg组Akt的磷酸化水平较对照组明显升高(P<0.05).LY294002组Akt的磷酸化水平较HBeAg组明显降低(P<0.05),并且上清液中IL-12水平较HBeAg组明显升高(P<0.01),IL-10和IDO的水平较HBeAg组明显降低(P<0.01).结论 相对于HBcAg的正性作用,HBeAg通过PI₃K-Akt信号通路调节DCs细胞因子分泌,减弱DCs的免疫功能,这可能是乙型肝炎慢性化的机制之一.     

HBV S-ecdCD40L融合基因修饰对树突状细胞功能的影响

目的探讨HBVS—ecdCD40L融合基因修饰对树突状细胞（DC）功能的影响。方法分离健康成人外周血单个核细胞,GM—CSF、IL-4诱导培养树突状细胞,培养第5天,以脂质体介导转染,分为pcDNA3．1-S—ecdCD40L转染组、pcD—NA3．1-S转染组、pcDNA3．1转染组及PBS对照组。转染48h收集DC及上清,流式细胞仪检测DC表面CD80、CD86、HLA—DR表达水平;CCK-8法检测混合淋巴细胞反应（MLR）中DC刺激同种异体淋巴细胞增殖的能力;酶联免疫吸附试验（ELISA）检测IL-12的分泌水平。结果与对照组比较,pcDNA3．1-S—ecdCD40L转染组DC表达CD80、CD86、HLA—DR水平增加,刺激同种异体淋巴细胞增殖的能力增强,分泌IL-12水平增高。结论HBVS—ecdCD40L融合基因修饰能促进DC活化。增强DC功能,将CD40L胞外段基因与HBV抗原基因融合可能是增强乙肝疫苗免疫效果的有效方法。     

ICAM-1基因多态性与HBV感染不同临床结局之间的关系

目的探讨细胞间黏附分子l（ICAM-1）基因多态性与HBV感染不同临床结局之间的相关性。方法应用病例．对照研究和聚合酶链反应-序列特异性引物法（PCR-SSP）检测118例慢性持续性HBV感染患者（包括无症状HBV携带者、慢性乙型肝炎、乙肝后肝硬化患者）和60例HBV急性自限性感染者的ICAM-1基因G241R（G／A）、K469E（A／G）两个位点的多态性，比较各组间基因型和等位基因频率，并对数据进行统计分析。结果①ICAM-l G241R（G／A）位点总GG基因型频率在HBV慢性持续性感染组高于急性自限性感染组，但差异无统计学意义（X^2=1．38，P〉0．05）。②ICAM-1 K469E（A／G）位点，进展性肝病组（慢性乙型肝炎和肝硬化）总KK基因型和总K等位基因的频率与无症状携带者组和自限性感染组相比显著增高（X^2=8．60，P〈0．05；X^2=5．07，P〈0、05），而在自限性感染和无症状携带者之间却无显著差异。结论携带ICAM-1 K469E KK基因型和K等位基因的患者容易进展成慢性乙型肝炎甚至肝硬化，可致慢性HBV感染患者病情进展。     

MxA基因真核表达载体构建及体外抗HBV作用研究

目的克隆人类MxA基因,探索其细胞内直接抗HBV作用,以便寻求HBV及其他病毒感染的新的基因治疗靶点。方法以pHMG—MxA质粒载体为基础,构建人类MxA基因表达质粒,采用人HBV—DNA转染的2．2．15细胞株作为研究对象,以不同浓度的MxA基因转染进行干预培养,lamivudine（3TC）阳性对照,同时设立空白对照,观察对HBV表达和复制的影响。结果经过酶切鉴定证明重组MxA基因表达质粒pcDNA—MxA构建正确,转染2．2．15细胞后呈现出明显抑制HBV复制和表达作用,且与转染剂量有关;3TC组也见MxA的表达增高,HBV—DNA复制受到明显抑制。结论抗病毒基因MxA具有细胞内抗HBV的复制及抑制病毒抗原基因的表达作用。     

HBeAg对小鼠骨髓源性树突状细胞成熟的影响

目的 探讨HBe Ag对LPS诱导小鼠骨髓源性树突状细胞(DC)成熟的影响。方法 体外诱导C57BL/6小鼠骨髓细胞分化成未成熟树突状细胞,经CD11c磁珠分选纯化后将DCs随机分为空白对照组、LPS刺激组、HBe Ag+LPS刺激组。流式检测DC表型变化,混合淋巴反应(MLR)检测DC促T淋巴细胞增殖能力,酶联免疫法(ELISA)检测细胞上清液中IL-12的分泌水平,Western blot检测p38磷酸化水平,并设置SB203580组为阳性对照探讨细胞IL-12分泌的可能调节机制。结果 LPS刺激未成熟DC引起细胞表面MHC-Ⅱ、CD86表达升高,刺激同种异体淋巴细胞增殖能力增强,IL-12分泌量增高。HBe Ag可抑制LPS促进DC表面MHC-Ⅱ、CD86表达升高和促淋巴细胞增殖能力增强的作用。LPS刺激DC可引起p38磷酸化水平升高,并呈时间依赖性;HBe Ag或SB203580预处理细胞再予LPS刺激,磷酸化p38表达和IL-12分泌较单纯LPS刺激组明显下降。结论 HBe Ag对LPS引起的树突状细胞的成熟有一定的抑制作用,且HBe Ag可能通过抑制p38MAPK信号通路下调LPS诱导的树突状细胞IL-12的产生。