FITC标记葡聚糖粘附定量测定肿瘤组织血管密度

目的:测定肿瘤组织异硫氰酸荧光素标记的葡聚糖(FITC-dextran)粘附水平是否可作为肿瘤血管密度的量化指标.方法:用endolgin疫苗免疫小鼠后,在同一只小鼠上同时建立小鼠Meth A纤维肉瘤模型和藻酸盐包被肿瘤细胞试验模型,2周后将FITC-dextran注射入小鼠体内,然后手术完整摘取肿瘤组织和藻酸盐颗粒,取部分肿瘤组织进行免疫组化检测血管密度的同时,将其他组织和藻酸盐颗粒匀桨并离心,取上清检测荧光强度,分析二者之间是否存在直线相关关系.结果:免疫组化和肉眼观察显示2种测定方法均有明显的血管生成效应,用FITC-dextran粘附测定肿瘤组织血管相对密度和藻酸盐包被试验均能较好地量化测定抗血管生成效果,直线相关分析表示二者的疫苗免疫实验组FITC-dextran的测定值之间呈明显的正性相关关系(r = 0.962,P＜0.01).结论:和藻酸盐包被试验相比,FITC-dextran测定肿瘤组织血管相对密度是一种简单有效的量化测定肿瘤组织血管生成水平的方法.     

小鼠VCAM-1真核表达质粒的构建及表达

目的:构建小鼠血管细胞粘附分子-1(VCAM-1)基因真核表达质粒,了解该质粒是否能在真核细胞中有效表达.方法:以小鼠胚肝组织总RNA为模板,通过RT-PCR扩增小鼠VCAM-1全段基因cDNA,应用基因工程技术将扩增的cDNA片段插入pcDNA3.1( )真核表达质粒,构建重组真核表达质粒pcDNA-mVCAM,经限制性内切酶酶切分析及测序鉴定正确后,用脂质体转染技术转染CHO细胞,用Western Blot鉴定该质粒是否能够在真核细胞中表达相应的目的蛋白质.结果:成功扩增了小鼠VCAM-1全长基因cDNA,酶切和测序证明正确构建了重组真核表达质粒pcDNA-mVCAM,Western Blot方法证实该质粒能在CHO真核细胞中正确表达目的蛋白.结论:成功构建了小鼠VCAM-1基因的真核表达质粒载体,为进一步研究VCAM-1的新功能和免疫治疗奠定了基础.     

重组Ag43-CD154嵌合蛋白诱导抗肝纤维化免疫反应

目的:了解基因工程技术构建制备获得的CD154-Ag43重组嵌合蛋白是否能够诱导产生抗自身抗CD154抗体的免疫反应。方法:将CD154-Ag43重组蛋白作为模式疫苗免疫刀豆素蛋白诱导肝纤维化模型小鼠,用免疫印迹和酶联免疫斑点试验了解是否能够诱导产生抗CD154抗体,用HE染色观察肝脏纤维化状态,用Masson trichrome和硝酸银染色观察肝脏组织胶原蛋白和网状纤维。结果:免疫印迹发现CD154-Ag43免疫的小鼠可以有效产生抗自身CD154抗体,酶联免疫斑点试验发现脾脏中有特异分泌抗CD154抗体的B淋巴细胞。肝脏组织HE染色发现CD154-Ag43免疫的肝纤维化模型小鼠肝脏纤维化明显轻于对照组,并且肝脏胶原蛋白和网状纤维也明显少于对照组。结论:基因工程技术构建制备获得的CD154-Ag43嵌合蛋白有可能是一种防治肝纤维化的有效模式疫苗。     

弓形虫ROP5基因与基因佐剂IL-12对小鼠免疫保护性

目的 观察弓形虫ROP5基因疫苗和基因免疫佐剂IL-12共免疫对昆明小鼠所诱导的免疫保护性。方法 大量制备重组质粒pcROP5和pcmIL-12,以100 μg的剂量同时免疫昆明小鼠,PBS组和pcDNA3.1空质粒组作为对照。用ELISA法测定免疫鼠血清中特异性抗体IgG、IgG亚型的表达水平及细胞因子IFN-γ、IL-4的含量,MTT法测定淋巴细胞转化率,观察小鼠受攻击感染弓形虫后的存活时间。结果 质粒pcROP5和pcmIL-12共免疫小鼠3次后,与pcROP5质粒单独免疫组和对照组相比,IL-12基因佐剂的共免疫提高了免疫鼠血清中特异性抗体IgG及IgG亚型IgG2a的表达水平,提高了细胞因子IFN-γ的含量,增加了淋巴细胞的转化率,但IgG1和IL-4的表达水平变化不大;攻击感染后,质粒pcROP5和pcmIL-12共免疫组小鼠存活时间显著延长。结论 弓形虫ROP5基因与基因佐剂pcmIL-12共免疫能增强对小鼠的免疫保护性。     

大肠埃希菌JM109表面抗原 Ag43基因敲除与鉴定

目的：敲除大肠埃希菌JM109表面抗原43（Ag43）基因并对其进行鉴定。方法采用Sigma公司的TargeTron基因敲除系统和Ag43基因特异设计的PCR引物扩增获得突变Ⅱ组内含子RNA蛋白复合体（RNP）基因序列,然后将这段基因序插入表达RNP的质粒pACD4K‐C中,获得Ag43特异的重组RNP质粒pACD4K‐Ag43。最后将pACD4K‐Ag43转化JM109,经过IPTG诱导表达将Ⅱ组内含子插入Ag43特异的部位。结果通过软件分析发现插入Ⅱ组内含子的最佳位点位于碱基1812和1913之间,琼脂糖凝胶电泳发现PCR扩增的突变Ⅱ组内含子RNP基因序列分子量大小和预期值（350 bp）相一致,用NheⅠ和HindⅢ二种酶切分析重组质粒pACD4K‐Ag43结果和预期值相符,PCR扩增相应产物和基因测序显示Ⅱ组内含子特异地插入Ag43基因碱基序列的1812／1913位点。结论成功地将大肠埃希菌JM109中的基因敲除,为更进一步深入研究Ag43基因的功能和将其作为制备重组Ag43嵌合蛋白的宿主菌奠定了基础。     

16S rRNA测序鉴定一株感染实验小鼠的表皮葡萄球菌

目的:应用16SrRNA测序及序列分析方法来鉴定一株来自实验室饲养小鼠的细菌。方法:对可疑小鼠的血液进行细菌培养,革兰氏染色观察细菌菌株的表型,PCR扩增菌株16SrRNA并进行测序,将测序序列与GenBank数据库的菌株序列进行进化树和基因距离分析。结果:本研究鉴定的菌株为革兰氏阳性表皮葡萄球菌。结论:16SrRNA基因测序鉴定细菌的方法适用于非专业研究人员;实验动物也可能含有病原体,进行动物实验时要有防护措施。     

不同纯度的有机溶剂对2株肿瘤细胞的抑制作用

目的 给脂溶性的抗肿瘤药物筛选高溶解性、低细胞毒性的有机溶剂.方法 采用MTT法,按照不同纯度,对8种能溶于水的有机溶剂,测试其对黑色素瘤B16、人胃癌细胞SGC-7901两种细胞株的细胞毒性.结果 不同有机溶剂对不同细胞株的抑制皆不同,甲醇与丙酮对两种细胞株的毒性相对都较弱,纯度越高的有机溶剂对细胞毒害越小.结论 光谱纯的甲醇与丙酮是脂溶性抗肿瘤药物有效的有机溶剂.     

伯氏疟原虫抗原基因高效植物表达载体的构建

目的构建果实特异启动子驱动的含伯氏疟原虫裂殖子表面蛋白PbMSP4/5(Plasmodium berghei merozoitesurface protein4/5)基因的植物表达载体,并进一步提高抗原基因的表达量和免疫原性,为研制有效的转基因植物疟疾疫苗打下基础。方法分别以提取的番茄和伯氏疟原虫Anka株的基因组DNA为模板,扩增番茄果实特异表达启动子E8的核心序列(约1.11Kb)及PbMSP4/5基因(704bp),并通过重叠区扩增基因拼接法(Gene splicing by overlap extension,SOE)PCR将二者拼接,拼接后的序列为EM,并合成霍乱毒素B亚基基因CTB,共同构建重组质粒pCAMBIA1302-EM-CTB,电击法转化根癌农杆菌GV3103。结果重组质粒经酶切鉴定证明已成功转化。结论实验成功构建了以番茄果实特异启动子驱动PbMSP4/5基因、以CTB为黏膜免疫佐剂的高效植物表达载体。     

羊膜及羊膜来源细胞应用于组织再生工程的研究进展

组织再生可分为体外组织再生和体内组织再生。体外组织再生是于体外设计、构建人体组织,并用于移植,以替换或修复病损组织。体内组织再生是把含有活细胞成分或不含细胞成分的装置植入体内,以诱导和促进功能组织的再生。这一方法除了要求设计、制备新型生物活性材料以提供细胞粘附和生长的基质外,还需要生长因子等辅助生物材料诱导组织再生。因此,细胞、支架和生长因子就成为构建工程组织的3个关键因素。羊膜具有很多特性,使其可作为组织工程中的支架;另外,羊膜本身就可以表达多种生长因子。就细胞来源而言,     

伯氏疟原虫裂殖子表面蛋白PbMSP4/5基因高效植物表达载体的构建

[目的] 构建果实特异性启动子驱动的含伯氏疟原虫裂殖子表面蛋白PbMSP4/5(Plasmodium berghei merozoite sHrface protein 4/5)基因的植物表达载体,进一步提高目的基因的表达量,为研制有效的转基因植物疟疾疫苗打下基础. [方法] 分别以提取的番茄和伯氏疟原虫的基因组DNA 模板,通过SOE PCR,即重叠区扩增基因拼接法(gene splicing by overlap extension)拼接番茄果实特异表达启动E8的核心序列(约1.11 Kb)及PbMSP4/5基因(704bp),拼接后的序列为EM.用EcoRI和Hind Ⅲ分别双酶切EM序列及表达载体pCAMBIA1302,连接转化,得到的重_组质粒pCAMBIA1302-EM用电击法转化根癌农杆菌GV3103. [结果] 重组质粒经PcR及酶切鉴定证明已成功转化.[结论] 本实验成功构建了番茄果实特异性启动子驱动PbMSP4/5基因的植物表达载体.