结核分枝杆菌复苏因子E的真核表达及鉴定

目的 构建结核分枝杆菌复苏因子E基因的真核表达质粒.方法 PCR扩增结核分枝杆菌复苏因子E基因片段.将片段克隆至PcDNA 3.1(一)载体,重组质粒测序正确后,转染至CHO细胞中,表达复苏因子E蛋白质.RT-PCR检测克隆基因mRNA在真核细胞中的表达,收集并纯化表达的蛋白质,SDS-PAGE分析和Western blot分析检测目的 蛋白的表达,淋巴细胞增殖实验(CCK-8)鉴定表达蛋白的免疫原性.结果 成功构建了结核分枝杆菌复苏因子E基因的真核表达质粒.RT-PCR证实克隆基因mRNA在真核细胞中表达,SDS-PAGE分析和Western blot分析均证实目的 蛋白在真核细胞中成功表达,淋巴细胞增殖实验(CCK-8)进一步证实了表达蛋白具有免疫原性.结论 我们成功构建了复苏因子E真核表达系统.     

复苏因子E-DNA疫苗对BALB/C小鼠免疫效应的研究

目的:探索复苏因子E(RpfE)-DNA疫苗的小鼠免疫效果.方法:利用真核表达栽体PCDNA3.1构建PCDNA3.1-RpfE重组质粒.将SPF级BALB/C小鼠随机分为5组,即空质粒组、RpfE质粒组、BCG组、生理盐水组、空白对照组,于0、3、6周先后3次免疫小鼠,在第3次免疫后3周,心脏取血ELISA方法检测血清RpfE IgG抗体效价、干扰素γ(IFNγ)水平;并行脾淋巴细胞培养,以RpfE蛋白刺激淋巴细胞,CCK-8法检测淋巴细胞增殖指数、ELISA方法检测上清诱导IFNγ和白介素12(IL-12)产生水平,乳酸脱氢酶试验检测小鼠脾细胞毒性T淋巴(CTL)杀伤效应.结果:(1)RpfE质粒组小鼠血清中RpfE抗体水平明显高于其他各组(P<0.001);RpfE质粒组IFNγ水平明显高于空质粒组、生理盐水组、空白对照组和BCG组(P<0101或P<0.05).(2)RpfE质粒组具有较强的刺激淋巴细胞增殖作用,CCK-8实验表明其增殖指数高于其他各组(P<0.05);上清ELISA检测表明IFNγ和IL-12产生水平也高于其他各组(P<0.05).(3)RpfE质粒组脾淋巴细胞特异性CTL杀伤性与其他各组比较有统计学意义(P<0.05).结论:RpfE-DNA疫苗可诱导小鼠的免疫应答,具有良好的体液和细胞免疫原性.