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1.
目的比较腺病毒载体Ad-BMP-2-内部核糖体进入位点(internal ribosome entry site,IRES)-低氧诱导因子1α突变型(hypoxia inducible factor 1αmu,HIF-1αmu)与Ad-巨细胞病毒(cytomegalovirus,CMV)-BMP-2-IRES-人源化海肾绿色荧光蛋白1(human renilla reniformis green fluorescent protein 1,hrGFP-1)分别转染BMSCs后的成骨效应,优化成骨细胞种子来源。方法取1月龄新西兰大白兔骨髓分离培养BMSCs。取第3代BMSCs进行病毒液转染,根据转染病毒液不同将实验分为4组,A、B、C组分别采用感染复数(multiplicity of infection,MOI)为50、100、150和200的Ad-BMP-2-IRES-HIF-1αmu、Ad-CMV-BMP-2-IRES-hrGFP-1、Ad-CMV-IRES-hrGFP-1(空腺病毒载体)转染细胞,D组为未被转染的BMSCs。选择最佳MOI值进行观察。转染后采用免疫组织化学染色检测BMP-2表达,Western blot检测BMP-2和HIF-1α蛋白表达,ALP活性测定和钙结节茜素红染色检测细胞成骨分化能力。结果 A、B、C组最佳MOI值分别为200、150和100。免疫组织化学染色示,A、B组BMP-2染色呈阳性,C、D组呈阴性;A组阳性细胞数明显多于B组(P<0.05)。Western blot检测示,A、B组BMP-2蛋白表达明显高于C、D组(P<0.05),A组高于B组(P<0.05);A组HIF-1α蛋白表达明显高于其余3组(P<0.05),其余3组间差异无统计学意义(P>0.05)。A、B组ALP活性明显高于C、D组(P<0.05),A组高于B组(P<0.05)。茜素红染色示,A、B组可见明显钙结节,C、D组未见钙结节形成;且A组钙结节数量多于B组(P<0.05)。结论单载体双基因Ad-BMP-2-IRES-HIF-1αmu与单载体单基因Ad-CMV-BMP-2-IRES-hrGFP-1分别转染兔BMSCs后,前者BMP-2和成骨效应表达均高于后者。 相似文献
2.
目的利用GatewayTM技术构建含大鼠锌转运体1(ZnT1)基因重组腺病毒载体,鉴定外源基因在真核细胞中的良好表达。方法采用化学合成的方法,合成ZnT1/RES/EGFP目的基因片段,通过PCR方法在基因片段两端加入attB重组位点,与含有attP重组位点的pDonr221供体载体BP反应形成入门载体pDown-ZnT1。将含有attL重组位点的入门载体与含有attR位点目的载体Ad/CMV/V5-DEST通过LR反应形成腺病毒表达载体pAd-ZnT1。酶切和测序鉴定后,由PacⅠ酶切线性化转染HEK293A细胞包装,提取病毒颗粒。采用终点稀释法测定重组腺病毒滴度;Western blotting技术分析目的蛋白表达情况。结果目的基因按正确的方向重组入克隆载体中,重组腺病毒表达载体在HEK293A细胞中包装成功,获得成熟的腺病毒颗粒,病毒滴度为1.6×108 pfu/L,在HEK293A细胞中高表达。结论该实验采用GatewayTM技术构建了含有大鼠ZnT1基因的重组腺病毒载体,为下一步研究该基因在脊髓神经细胞中的表达以及与BDNF/TrkB信号调节通路的关系奠定了基础。 相似文献
3.
目的构建腺病毒穿梭质粒pShuttle CMV--+VEGF_(121)-IRES-hrGFP-1,为构建表达具有抗原表位标记的血管内皮生长因子121(vascular endothelial growth factor 121,VEGF_(121)),并同时表达绿色荧光蛋白(green fluorescent protein,GFP)报告分子的腺病毒真核细胞表达载体打下基础。方法对目的基因供体质粒pTG19T-VEGF_(121)携带的VEGF_(121)基因测序和序列内部存在的限制性内切酶识别位点进行分析,利用PCR(Polymerase Chain Reaction,PCR)技术对pTG19T-VEGF_(121)携带的VEGF_(121)基因突变,以去除翻译终止密码子后的基因序列并在序列前后分别添加新的NotI和XhoI酶切位点。将突变后的VEGF_(121)基因(-+VEGF_(121))定向连入腺病毒穿梭质粒pShuttle CMV-IRES-hrGFP-1,通过电泳和测序鉴定获得的重组质粒。结果重组质粒经电泳和测序鉴定为正确克隆。结论成功构建了pShuttle CMV--+VEGF_(121)-IRES-hrGFP-1。 相似文献
4.
丹参粉针剂对四氯化碳致大鼠慢性肝纤维化的保护作用 总被引:3,自引:0,他引:3
目的:探讨丹参粉针剂对四氯化碳(CCl_4)致大鼠慢性肝纤维化的保护作用。方法:SD大鼠随机分为正常组、模型组、阳性对照组(葡醛内酯注射液26.5 mg·kg~(-1))和丹参粉针剂低、中、高剂量组(100,250, 500 mg·kg~(-1)),除正常组外的其余各组动物先在饮水中加入350 mg·L~(-1)的苯巴比妥诱导2周,然后腹腔注射CCl_4 0.04 mL·kg~(-1)建立慢性肝纤维化模型,每周1次,共注射8周。于注射CCl_4第5周时,各组分别腹腔注射生理氯化钠溶液或相应剂量的药物,在给药2,4,6周后测定血清中谷丙转氨酶(ALT)、谷草转氨酶(AST)活性和前胶原肽(PIIIP)、层黏连蛋白(LN)、透明质酸(HA)的含量。结果:丹参粉针剂低、中、高剂量组和阳性对照组大鼠血清中ALT,AST活性和PIIIP,LN,HA含量均比模型组明显降低(P<0.01~P<0.05)。结论:丹参粉针剂对CCl_4致大鼠慢性肝纤维化具有保护作用。 相似文献
6.
血管内皮生长因子121和骨形态蛋白2双基因共表达重组腺病毒载体的构建及鉴定 总被引:1,自引:0,他引:1
背景:人血管内皮生长因子121和骨形态蛋白2在激素性股骨头坏死骨缺损中均具有成血管成骨作用,目前国内在以人血管内皮生长因子121和骨形态蛋白2基因联合治疗激素性股骨头坏死方面少有报道。
目的:构建人血管内皮生长因子121与人骨形态发生蛋白2双基因腺病毒穿梭质粒。
方法:将质粒pShuttle-CMV-VEGF121-IRES-hrGFP-1经Kpn Ⅰ/Xba Ⅰ酶切后,将BMP2片段定向连入pShuttle-CMV- VEGF121-IRES,构建可同时表达2个目的基因重组质粒pShuttle-CMV-V EGF121-IRES-BMP2,注入H5a细胞扩增,铺板,筛选阳性菌落,提取质粒,进行酶切分析及序列测定。将已构建确认正确的腺病毒质粒,经BJ5183-AD-1电转感受态细胞进行电穿孔后,铺板,筛选阳性菌落,提取质粒,进行酶切分析,PCR检测和序列分析。
结果与结论:酶切分析及核酸序列测定证实重组质粒构建正确,提示实验成功构建了血管内皮生长121及骨形态蛋白2双基因共表达重组腺病毒载体。 相似文献
7.
背景:低氧诱导因子1能够调控多种基因共同表达,在骨缺损部位可诱导成熟的血管生成,为各种细胞的成骨分化和成骨活动提供营养支持和代谢保证,促进骨愈合,但其真核表达载体的构建及表达却少见报道。
目的:实验拟构建携带低氧诱导因子1αmu(hypoxia inducible factor 1 alpha,HIF-1α)目的蛋白和人源化海肾绿色荧光蛋白(human renilla reniformis green fluorescent protein,hrGFP)的双基因真核表达载体,并将其转染HEK293A细胞,观测其在细胞中的表达。
方法:利用PCR技术定点突变目的基因供体质粒pCMV6-XL5-HIF1α携带的人HIF1α基因编码区的第402位、564位和803位氨基酸以及去掉其终止密码子,之后在基因序列前后添加新的酶切位点Not Ⅰ和Pvu Ⅰ,酶切、测序检测突变情况,将正确突变的HIF1αmu定向连入腺病毒穿梭载体pShuttle-CMV-IRES-hrGFP-1中。经测序鉴定、Pme Ⅰ酶切线性化后转化BJ5183-AD-1电感受态细胞,通过hrGFP基因荧光表达检测转染情况。
结果与结论:经基因测序证实,HIF-1α基因编码区的第402位、564位和803位氨基酸均定点突变成丙氨酸,终止密码子成功去除。经酶切鉴定及测序证实,重组腺病毒表达载体构建成功。荧光显微镜下观察表明,感染重组腺病毒的HEK293A细胞内有大量绿色荧光表达证实通过Lipofectamine 2000途径可使得重组腺病毒载体成功转染HEK293A细胞。
关键词:低氧诱导因子1α;基因突变;腺病毒载体;绿色荧光蛋白;HEK293A细胞
doi:10.3969/j.issn.1673-8225.2010.46.011 相似文献
8.
背景:人血管内皮生长因子121和骨形态蛋白2在激素性股骨头坏死骨缺损中均具有成血管成骨作用,目前国内在以人血管内皮生长因子121和骨形态蛋白2基因联合治疗激素性股骨头坏死方面少有报道。
目的:构建人血管内皮生长因子121与人骨形态发生蛋白2双基因腺病毒穿梭质粒。
方法:将质粒pShuttle-CMV-VEGF121-IRES-hrGFP-1经Kpn Ⅰ/Xba Ⅰ酶切后,将BMP2片段定向连入pShuttle-CMV- VEGF121-IRES,构建可同时表达2个目的基因重组质粒pShuttle-CMV-V EGF121-IRES-BMP2,注入H5a细胞扩增,铺板,筛选阳性菌落,提取质粒,进行酶切分析及序列测定。将已构建确认正确的腺病毒质粒,经BJ5183-AD-1电转感受态细胞进行电穿孔后,铺板,筛选阳性菌落,提取质粒,进行酶切分析,PCR检测和序列分析。
结果与结论:酶切分析及核酸序列测定证实重组质粒构建正确,提示实验成功构建了血管内皮生长121及骨形态蛋白2双基因共表达重组腺病毒载体。 相似文献
9.
目的研究转染低氧诱导因子-1α突变型(hypoxiainduciblefactor-1α^mu,HIF-1α^mu)后的外源性内皮祖细胞(endothelialprogenitorcells,EPCs)中CXCL12的表达情况及对EPCs的影响。方法密度梯度离心结合差速贴壁法分离、培养EPCs并进行鉴定;以Adv—HIF-1α^mu的最佳转染指数转染EPCs,获得含有目的基因处理的EPCs细胞,设为A组。B组为单纯转染Adv的EPCs。设未转染Adv—HIF-1α^mu的EPCs为C组。WesternBlot检测转染后的EPCs中HIF-1的表达,检测转染后的EPCs培养液上清液中的CXCL12浓度及其对外源性EPCs迁移的影响。结果密度梯度离心结合差速贴壁法获得的EPCs能够结合UEA-1和摄取ac—LDL,并具有成血管作用;转染Adv—HIF-1α^mu的EPCs表达的HIF-1及CXCL12高于单纯转染Adv的EPCs及未转染Adv—HIF-1α^mu的EPCs(P〈0.05),且能诱导外源性EPCs的迁移。结论密度梯度离心结合差速贴壁法能够分离、培养符合特征的EPCs,转染Adv—HIF-1α^mu的EPCs能够在常氧条件下高表达HIF-1及CXCL12,并诱导外源性EPCs的迁移。 相似文献
10.
背景:血管内皮生长因子具有促进血管生成的作用,在骨缺损的治疗研究中运用较多,但其异构体VEGF121的研究较少.目的:构建携带VEGF121-FLAG和hrGFP-1基因的腺病毒表达载体并观测其在骨髓基质干细胞中的表达.方法:以pTG19T-VEGF121为模板利用PCR技术突变VEGF121基因以去除VEGF121基因中终止密码子,之后在基因序列前后分别加入NotⅠ和XhoⅠ酶切位点,并将得到的基因亚克隆至pMD19-T质粒上,双酶切pMD19-T-VEGF121和pShuttle-CMV-IRES- hrGFP-1质粒,凝胶回收小片段和大片段,后进行连接反应,完成穿梭质粒的构建.重组病毒物理滴度测定后感染骨髓基质干细胞,在荧光显微镜下观察荧光强度.结果与结论:经酶切鉴定及基因测序证实重组腺病毒质粒构建成功, 荧光显微镜下观察表明, 感染重组腺病毒的骨髓基质干细胞有明显的绿色荧光表达.可见构建的携带VEGF121-FLAG和hrGFP-1基因的腺病毒表达载体可在真核细胞表达, 有可能用于缺血性疾患的基因治疗. 相似文献