杀微生物剂临床前安全性评价模型研究进展

近年来,性传播已经成为全球艾滋病病毒(HIV)传播的主要途径。在HIV疫苗研究暂时受挫的情况下,用于保护生殖道、直肠等局部粘膜部位免于HIV感染的杀微生物剂研究,受到越来越多的重视。而在进入临床前,对杀微生物剂进行全面可靠的安全性评价,是必不可少的重要步骤。该文对杀微生物剂安全性评价的各个阶段所采用的评价模型,包括细胞模型、组织模型和动物模型进行了介绍,对各种模型的优缺点及最新进展进行了阐述。指出从分子水平上建立一套合理、科学的检测指标和方法,是目前完善各种模型的当务之急。     

四种hGM-CSF/IL-6融合蛋白的基因构建、表达及活性比较

目的 构建及表达具有hGM-CSF和hIL-6双重生物学活性的hGM-CSF／IL-6融合蛋白分子。方法 应用PCR技术对hGM-CSF和hIL-6的基因分别加以改造，同时在二者之间加上连接肽序列(G-G-S-G-S)3，克隆PCR产物，并构建成克隆有4种融合蛋白基因的pBV220表达质粒，4种融合蛋白分别是GM-CSF(9～127)-IL-6(29～184)(简称GII)、GM-CSF(9～127)-IL-6(1～184)(简称GL2)、GM-CSF(1-127)-IL-6(1—184)(简称GI3)、GM-CSF(9-127)-IL-6(24～184)(简称GI4)，表达质粒分别导入E．coli BL-21中诱导表达。通过Q Sepharose HP离子交换柱和Sephacryl S-200分子筛柱二步柱纯化以获取目的蛋白。使用hGM—CSF依赖细胞株TF1和hIL-6依赖细胞株B9通过MTT法测量融合蛋白的生物学活性。结果 对4种融合蛋白基因的测序结果表明，其序列与理论设计完全一致，表达质粒在E．coli BL-21中均得到高效表达，表达的融合蛋白均占到总蛋白含量的30％以上，表达产物以包涵体的形式存在，通过Q Sepharose HP离子交换柱和Sephacryl S-200分子筛柱二步柱纯化及复性后获得4种目的蛋白，其纯度均达到95％以上。活性测定结果表明4种融合蛋白均具有较高的hGM-CSF和hIL-6的双重生物学活性。结论 获得了具有较高纯度和双重生物学活性的GM-CSF／IL-6融合蛋白。     

HIV感染者B淋巴细胞功能损伤机制的研究进展

1983年的一项研究首次揭示了AIDS病人的B细胞出现高活化和功能损伤等异常现象[1],提示HIV感染不仅导致细胞免疫的功能缺陷,而且也能引起体液免疫的功能损伤.HIV感染诱导的B细胞变化主要表现在两方面:一方面是亚群上的变化,体现在未成熟/过渡型B细胞亚群、活化B细胞和浆细胞亚群、以及组织样记忆B细胞亚群增加,而初始和CD27+记忆B细胞亚群减少[2-4];另一方面是功能上的变化,包括高度异常活化、易于凋亡、HIV特异性或非特异性抗体反应性低[5-7]等.B细胞功能损伤使得体液免疫应答缺陷,HIV病毒不能得到有效控制,同时,还会增加机会感染和二次感染的易感性.因此,深入理解HIV感染过程中B细胞功能损伤的机制,不仅能通过改善体液免疫来减少机会感染和二次感染的发生,也为基于抗体的疫苗研究提供了依据.     

利用小鼠炎症模型评价苯扎氯铵的黏膜毒性

目的利用小鼠黏膜炎症因子模型,研究不同浓度苯扎氯铵(BZK)对生殖道黏膜的刺激毒性,以探究BZK作为黏膜用药物的安全性和应用前景。方法连续三天用浓度为0.02%、0.2%和2%的BZK凝胶处理小鼠阴道黏膜,每天收集小鼠阴道灌洗液,用多指标流式蛋白定量技术(Cytometric Bead Array,CBA)检测其中的6种炎症因子[白介素(Interleukin,IL)-2、IL-4、IL-6、IL-17A和肿瘤坏死因子(Tumor necrosis factor,TNF)-α、γ干扰素(Interferonγ,IFN)-γ]的表达情况;利用苏木紫-伊红(Hematoxylin-Eosin,HE)染色法对小鼠阴道黏膜的病理学损伤情况进行观察。结果 2%的BZK凝胶诱导了较为明显的小鼠阴道黏膜上皮损伤,0.02%和0.2%的BZK与安慰剂组相比无明显病理改变;但是0.2%的BZK显著上调了IL-6和TNF-α在阴道灌洗液中的表达,而0.02%和2%的BZK诱导的各炎症因子与安慰剂组相比差异无统计学意义。结论 2%和0.2%的BZK具有一定的黏膜毒性;0.02%的BZK展现了较好的安全性,该浓度下BZK的病原体感染抑制能力需要进一步研究确认。     

HIV-1潜伏感染人Jurkat T细胞模型的建立

目的 建立Ⅰ型艾滋病病毒(HIV-1)潜伏感染人Jurkat T细胞的模型,为进一步研究HIV-1潜伏感染机制奠定基础.方法 利用一种表达增强型绿色荧光蛋白( EGFP)的HIV-1假病毒感染人Jurkat T细胞,采用流式细胞术分选出GFP -细胞群,之后经激活剂曲古抑菌素A(Trichostatin A,TSA...     

实时相对定量反转录PCR检测小鼠阴道黏膜炎症因子的表达

目的建立实时相对定量反转录聚合酶链反应(real-time RQ RT-PCR)方法,能快速准确地检测各种炎症因子在阴道黏膜的转录表达情况,从而评价包括杀微生物剂在内的生殖道或直肠黏膜用候选药物的刺激毒性。方法以Eppendorf Mastercycler ep realplex实时荧光定量PCR仪为检测平台,选择小鼠β-actin基因为内参,建立基于SYBR GreenⅠ荧光染料的real-time PCR检测方法,对白介素2(Interleukin 2,IL-2)、IL-4、IL-6、IL-10、IL-17A、肿瘤坏死因子α(Tumor necrosis factorα,TNF-α)、γ干扰素(Interferonγ,IFN-γ)等炎症因子在生殖道黏膜的mRNA转录水平,同时进行检测,并用2-⊿⊿Ct方法计算实验组小鼠目的基因相对于空白组小鼠的表达差异情况。用微量样本多指标流式蛋白定量技术(Cytometric Bead Array,CBA)对结果进行验证。结果使用real-time RQRT-PCR能对小鼠阴道黏膜炎症因子的表达情况进行快速检测,结果与CBA检测结果相吻合。结论该方法快速、灵敏、特异性强、价格低廉、高通量。可用于杀微生物剂等生殖道或直肠黏膜用候选药物的临床前安全性评价工作。     

HIV相关的黏膜免疫及疫苗策略

联合国艾滋病规划署发布的《2012艾滋病疫情报告》显示:虽然艾滋病的蔓延趋势得到了一定程度的遏制,但2011年,全球新发感染人数仍然高达250万,艾滋病相关死亡人数也高达170万,其中黏膜性途径传播成为HIV感染的重要方式[1].HIV对机体造成的免疫损伤并不局限于血液系统,亦可影响黏膜免疫系统,特别是肠相关淋巴组织(MALT).有证据显示:无论通过黏膜途径抑或血液途径,HIV-1感染后总是最先在肠相关淋巴组织内造成CD4+T细胞损伤[2],其中尤以肠固有层淋巴组织(gut lamina propria)为主.