粉尘螨6类变应原（Der f6）的克隆表达、纯化及免疫学特性鉴定

目的 构建粉尘螨6类变应原（Dermatophagoides farinae，Der f6）基因的高效原核表达载体，并进行表达、纯化及生物学功能分析。 方法 根据Der f6基因已知序列，设计1对引物，通过对纯培养的粉尘螨提取总RNA，采用RT-PCR方法扩增出Der f6基因片段，PCR产物克隆入pMD18-T载体，转化大肠埃希菌（E.coli Top10），经PCR和酶切鉴定并测序。将上述所得阳性克隆菌株扩大培养，碱裂解法提取质粒，所得重组质粒pMD18-T-Der f6和空质粒pET-24a同时用限制性内切酶EcoRⅠ和XhoⅠ双酶切，经纯化后连接并转化至E.coli Top10。构建的重组质粒pET24a-Der f6经PCR、酶切和测序鉴定后，再转化至E.coli BL21（DE3）， 异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）诱导表达。用十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）和蛋白质印迹法（Western blotting）鉴定其表达效果，用Ni+离子亲和层析柱纯化重组质粒pET24a-Der f6表达产生的组氨酸重组蛋白。 结果 构建了重组质粒pMD18-T-Der f6和pET24a-Der f6。SDS-PAGE 结果表明Der f6基因在E.coli Bl21(DE3）中获得良好的表达，所得重组蛋白相对分子质量(Mr) 为31 000, 与理论值一致, 经亲和层析纯化后，SDS-PAGE 结果显示单一条带。该蛋白以尘螨过敏患者血清进行Western blotting, 结果表明具有良好的IgE结合活性。 结论 克隆、表达并纯化了具有良好尘螨致敏患者IgE结合活性的Der f6。     

粉尘螨Der f18变应原的克隆表达、纯化及免疫学特性鉴定

通过对纯培养的粉尘螨提取总RNA,采用RT-PCR方法有效地扩增出Der f18片段,将Der f18连接到pET-24a表达载体上并转化到表达菌BL21(DE3)中,得到重组质粒pET-Der f18和重组工程菌.重组工程菌经IPTG诱导培养,高效表达出Der f18蛋白,SDS-PAGE结果显示表达产物约为52 kDa.表达产物经亲和层析纯化,用Western blot方法检测免疫学活性,结果表明目的蛋白具有良好的免疫原性.