鼠疫耶尔森菌小肽基因sORF34缺失株毒力及短期免疫保护效果评价

目的 探索小肽基因34(sORF34)缺失对鼠疫耶尔森菌毒力影响,并评价sORF34缺失株免疫保护活性。方法 基于鼠疫耶尔森菌201株和鼠疫耶尔森菌EV76疫苗株利用λ-Red一步法构建小肽基因缺失株。比较鼠疫小肽基因缺失株和亲本株之间的毒力差别,并采用皮下免疫方式对小鼠进行免疫,与EV76疫苗株比较,评价体液免疫、保护率等方面的差异。结果 PCR扩增结果证实,小肽基因缺失株构建成功。通过皮下LD₅₀测定、生存曲线测定,表明小肽基因缺失株较亲本株毒力下降。鼠疫201ΔsORF34和EV76ΔsORF34皮下免疫后可刺激机体产生抗F1-IgG,其中鼠疫201ΔsORF34免疫组抗体滴度与EV76疫苗株免疫组差异无统计学意义(P>0.05),EV76ΔsORF34免疫组较EV76疫苗株免疫组抗体滴度低;鼠疫EV76ΔsORF34株可刺激机体产生低滴度抗LcrV-IgG,而EV76和201ΔsORF34株不能刺激机体产生抗LcrV-IgG。初免后42 d使用致死剂量鼠疫201株进行皮下攻毒和滴鼻攻毒,3组保护率差异无统计学意义(P>0.05)。结论 小肽基因缺失株经皮下途径感染BALB/c小鼠的毒力下降,鼠疫EV76ΔsORF34株较EV76疫苗株残存毒力进一步下降,但保护率差异无统计学意义(P>0.05),EV76ΔsORF34株有作为鼠疫减毒活疫苗候选株的潜力。     

基于CRISPR/Cas12a的室温稳定鼠疫耶尔森氏菌检测体系的建立

目的 筛选并优化冻干保护剂组合，建立可室温稳定储存的、不影响试剂检测灵敏度的Cas12a鼠疫菌核酸检测冻干体系，为其应用于动物鼠疫监测的现场快速检测奠定基础。方法 以鼠疫耶尔森氏菌pla基因为靶基因，选择9种常用冻干保护剂加入核酸检测试剂中，筛选有明显保护效果的4种保护剂进行优化。按照正交实验设计原则设计保护剂组合，通过37℃加速破坏实验及26℃室温稳定性实验对复合保护剂进行保护效果和灵敏度评价。结果 加入蔗糖、山梨醇和海藻糖3种保护剂的冻干检测体系可在37℃稳定存放2周。室温下存放3个月后体系检测信号强度与37℃加速破坏1周时基本相当，同时检测方法的灵敏度依然能达到10^-5 ng/μL,说明Cas12a检测试剂加入筛选得到的保护剂冻干后，可在室温下稳定保存至少6个月。结论 本研究构建的室温稳定CRISPR/Cas12a鼠疫菌检测体系可在室温下稳定存放至少半年，能够满足鼠疫菌现场快速检测中对试剂稳定性的需求。同时，本研究获得的复合保护剂组分对构建其它室温稳定CRISPR/Cas12a核酸检测体系具有重要参考价值。