结核疫苗相关研究现状与展望

结核病,特别是多重耐药性结核病的暴发流行和严重危害性,引起人们的重视.随着耐药菌株与艾滋病的"同流合污",它又一次严重地威胁人类的生命与健康.这些都给此病的防御与治疗带来新的挑战,为此人们不可不对它再次提高警惕.至今,卡介苗(bacillus calmette querin,BCG)仍是预防结核病惟一可用疫苗,但其免疫保护效果极不稳定.过去20年中,分子生物学技术的应用使得新型候选疫苗大量涌现,其中重组BCG疫苗和DNA疫苗被认为是最有前途的候选疫苗.但所有疫苗共同的致命缺点是免疫保护力低.佐剂的研究将大大改观这一现状.因此,结核疫苗研究的努力方向还是在研究分支杆菌免疫机制和免疫失败的基础上,进一步增强现有候选疫苗的免疫效力或研制更为有效的新型疫苗.     

环介导等温扩增快速检测EBV DNA对鼻咽癌诊断的意义

目的:建立环介导等温扩增技术快速检测EB病毒的方法,为鼻咽癌的早期诊断提供辅助手段.方法:利用煮沸法快速提取样品中病毒DNA,使用环介导等温扩增技术检测EB病毒特异基因片段,在等温条件下于1 h内完成检测过程.结果:环介导等温扩增技术在对33份临床标本的检测中显示了较高的特异性,较现有的PCR技术更加简便快速,能在等温条件下进行,不需复杂的仪器设备,检测成本大大降低.结论:本研究为鼻咽癌临床检测提供了一个快速简便的新辅助方法.     

结核分枝杆菌环介导恒温扩增（LAMP）快速检测方法的评价

目的 对国内建立的结核分枝杆菌DNA环介导恒温扩增（loop-mediated isothermal amplification, LAMP）快速检测方法进行了介绍和评价。 方法 实验菌株来源于北京结核病胸部肿瘤研究所。以结核分枝杆菌作为研究对象,设计了4 条LAMP 引物特异地识别结核分枝杆菌中 gyr B 基因的6个特殊区域。所有的菌株样本提取DNA作为模板,加入LAMP反应管后,65 ℃恒温反应60 min即可。其结果可以通过肉眼观察到的颜色变化来判断。 结果 实验共验证了79株临床和标准菌株。对于菌株的培养物,LAMP实验的灵敏度为100%,特异度为92%。 结论 结核分枝杆菌LAMP快速检测方法是一种快速、可靠的结核分枝杆菌诊断方法。     

细胞因子和趋化因子作为DNA疫苗基因佐剂的研究进展

1990年第1次报道了编码外源抗原的裸露质粒DNA（naked plasmid DNA）注射小鼠后可以在体内表达抗原基因。尔后，一系列动物实验证明DNA疫苗能诱导针对其所编码抗原的体液或细胞免疫。由于DNA疫苗免去了烦琐的蛋白质表达与纯化步骤，更重要的是，基因在体内的表达及诱导免疫的过程，模拟了自然状态下机体感染外源病原生物表达抗原及诱导免疫的过程。因此，DNA疫苗系统一经建立，便很快成了抗感染、抗肿瘤免疫等领域的研究热点。     

霍乱弧菌LAMP快速检测方法的建立及应用

目的 建立环介导等温扩增技术(LAMP)快速检测霍乱弧菌.方法 针对霍乱弧菌外膜蛋白的ompW基因设计特异引物,优化反应条件,建立霍乱弧菌的LAMP检测方法.通过对47株细菌及模拟污染现场,检测该方法的灵敏度、特异度和实用性.结果 活菌计数方法表明建立的LAMP方法检测霍乱弧菌的灵敏度为1.6×10~2 cfu/ml.在人工污染霍乱弧菌的粪便及海水标本中检测的敏感度为1.6×10~3 cfu/ml,在牛奶标本中敏感度为1.6×10~4 cfu/ml.检测21株霍乱弧菌均为阳性,26株非霍乱菌则全部阴性,特异度为100%.结论 建立的LAMP方法检测霍乱弧菌灵敏度、特异度高,可用于霍乱现场监测和流行病学调查.

Abstract：

Objective To establish a loop-mediated isothermal amplification (LAMP) method for rapid diagnosis of Vibrio cholerae. Method Based on the ompW nucleic sequence of Vibrio cholerae, a pair of primers was designed for LAMP. The reaction conditions were optimized, and the specificity, sensitivity, and practicability of LAMP were tested using 47 baterial strains and simulated contaminated sites. Results The results of viable bacterium count showed that LAMP was capable of detecting Vibrio cholerae at a level as low as 1.6×10~2 cfu/ml. The minimal detectable concentration was 1.6×10~3 cfu/ml for simulated contaminated samples such as feces and seawater, and 1.6×10~4 cfu/ml for contaminated milk. All the 21 strains of Vibrio cholerae yielded positive results in LAMP, and the 26 strains of other bacteria all showed negative results, with a detection specificity of 100%. Conclusion The established LAMP method has high specificity and sensitivity for detecting Vibrio cholerae and is applicable in field monitoring and epidemiological study of Vibrio cholerae.     

霍乱弧菌O1群和O139群SXT基因扩增及其酶切分型

霍乱是一种烈性传染病，其致病菌为霍乱弧菌。根据菌体（O）抗原的不同，霍乱弧菌已被分为200个以上的O血清群，其中只有O1和O139群能引起霍乱大流行，其他群主要引起散发，因此，关于霍乱弧菌的检测包括O1群和O139群。霍乱弧菌的快速检测对控制霍乱流行及治疗有重要的意义。     

三类整合酶基因(intⅠ)的简并引物PCR方法建立及应用

目的建立一种筛选第一、二和三类整合酶基因(intⅠ)的简并引物PCR方法，并对临床菌株进行整合子筛选和分类。方法用梯度PCR方法确定PCR反应的最适退火温度，并对16株临床标本进行PCR扩增，通过对阳性PCR扩增产物的限制性内切酶分析进行整合子分类。结果根据梯度PCR结果确定最适退火温度为46℃。应用简并引物PCR法检测16株临床分离株，其中8株阳性，经酶切分类后确定其中4株只含有第一类整合酶基因，有3株含有第二类整合酶基因，1株同时含有第一类和第二类整合酶基因。结论建立了一种同时筛选第一、二和三类整合子的方法，实际检测显示其可行性，为全面细致研究整合子介导的细菌耐药提供了一种快速、简便的方法。     

结合RNAi技术的三重表达HCV DNA疫苗的构建及其在HepG2细胞中的表达

目的:构建多表位抗原基因、hIL-12、小分子干扰RNA(siRNA)共质粒表达的新型复合丙型肝炎DNA疫苗并在HepG2细胞中表达.方法:设计并合成复合多表位丙肝抗原基因,将其与加强型绿色荧光蛋白(EGFP)基因融合克隆进真核表达载体pVAX1的多克隆位点中;利用pVAX1载体上卡那霉素抗性基因与复制起始位点之间的非功能区域,将带CMV启动子的hIL-12表达单元克隆进该区域的BspH Ⅰ位点中;同时将8组针对丙肝的siRNA表达单元分别克隆进载体复制起始位点下游非功能区域的Mlu Ⅰ位点上,构建三重表达的HCV DNA疫苗pVAX1-HC-EGFP-hIL12-siRNA.以该重组质粒转染人肝癌细胞系HepG2,通过EGFP的荧光标记观察多表位抗原的表达;以靶向EGFP的siRNA做为对照验证siRNA的表达及其干扰效果;ELISA测定培养细胞上清中hIL-12的表达.结果:经酶切鉴定和测序证实三重表达的复合HCV DNA疫苗构建成功.在转染细胞中检测到绿色荧光,证实抗原表达;靶向EGFP的siRNA亦能显著抑制EGFP的表达;转染后48 h hIL-12的检出量为1 289 ng/L细胞上清,72 h检出量为1 712 ng/L细胞上清.结论:成功地构建多表位抗原基因、hIL-12和siRNA共质粒表达的丙肝DNA疫苗,并能在真核细胞中有效表达抗原基因、hIL-12并介导RNA干扰效应.为进一步研究该DNA疫苗抗HCV的免疫治疗和基因治疗效果打下基础.