肝癌相关抗原Kinectin的多克隆抗体制备、鉴定及初步应用

目的制备本课题组报告的肝癌相关抗原Kinectin的多克隆抗体,并鉴定其免疫学特性。方法以本课题组前期构建的人MBP-Kinectin融合片段重组质粒为基础,原核表达和亲和层析大量纯化MBP-Kinectin融合蛋白,并免疫新西兰兔制备多克隆抗体;用间接ELISA法测定抗体效价,用Western blot鉴定抗体的特异性。同时用Kinectin多克隆抗体检测Kinectin在正常成人肝细胞HL-7702和人肝癌细胞株SMMC-7721内的表达。结果通过免疫新西兰兔获得抗Kinectin抗体,ELISA测定纯化的Kinectin抗体效价最高为1∶12 800,Western blot结果显示Kinectin抗体具有较好的特异性。免疫细胞化学和western blot检测发现Kinectin蛋白在肝癌细胞株内的表达显著高于正常成人肝细胞株。结论制备的抗Kinectin抗体具有较高的效价和特异性,能满足Western blot和免疫细胞化学检测Kinectin蛋白的要求,为进一步深入研究Kinectin在肝癌发生发展中的作用奠定基础。     

p70S6K与eIF4E在肝癌中的表达及相关性

目的 探讨肝癌组织中p70S6K和eIF4E的表达及临床意义.方法 采用免疫组织化学S-P法检测55例肝细胞肝癌及癌旁硬化肝组织中p70S6K和eIF4E蛋白的表达情况,并分析两者的相关性及与临床病理特征的关系.结果 p70S6K和eIF4E在肝癌中的阳性表达率分别为85.5%和90.9%,高于癌旁硬化肝组织(P<0.05),其表达与肝癌的分化程度、临床分期以及有无门静脉癌栓有关,与患者的年龄、性别、肿瘤大小以及有无包膜无关,并且在肝癌组织中p70S6K和eIF4E蛋白表达呈正相关(rs=0.375,P=0.005).结论 p70S6K和eIF4E蛋白的异常表达与肝癌的发生发展及浸润转移有关,并且两者之间可能存在某种协同关系.     

红花栝楼鲨烯合酶基因的克隆及其序列分析

目的克隆红花栝楼鲨烯合酶(squalene synthase,SS)的基因并进行序列分析,为进一步研究葫芦科植物三萜合成通路关键酶SS的正选择位点与功能的关联性分析奠定基础。方法根据绞股蓝与罗汉果SS基因c DNA比对分析的结果,设计SS的5’端简并引物,采用3’RACE扩增红花栝楼SS全长c DNA基因。结果获得红花栝楼SS c DNA全长共1 466个核苷酸,其中包括一个含有1 254个核苷酸的开放读码框,编码417个氨基酸残基。通过NCBI的Blast比对,发现红花栝楼SS基因编码的氨基酸序列与已知植物SS基因编码的氨基酸序列同源性为78%~94%,核苷酸的同源性为74%~93%。结论成功克隆了红花栝楼SS的全长c DNA,为进一步研究红花栝楼SS基因结构、基因表达、基因突变提供了基础,并为葫芦科植物三萜合成通路关键酶SS的正选择位点与功能的关联性分析提供了数据支持。     

Kinectin-麦芽糖结合蛋白融合蛋白致敏树突状细胞对T细胞分化格局的改变

背景:Kinectin作为树突状细胞瘤苗可运用于肝癌临床免疫治疗.目的:检测kinectin-麦芽糖结合蛋白融合蛋白致敏的树突状细胞刺激T细胞亚群的分化情况.方法:运用免疫组化法检测kinectin-麦芽糖结合蛋白孵育的树突状细胞刺激增殖的T细胞中CD4+、CD8+ T细胞亚群活化情况,同时设立麦芽糖结合蛋白组、非致敏树突状细胞组及普通培养T细胞组作为比较.结果与结论:Kinectin-麦芽糖结合蛋白致敏树突状细胞刺激的T细胞组CD8+T细胞明显高于麦芽糖结合蛋白孵育树突状细胞刺激的T细胞组、非致敏树突状细胞刺激组及普通培养T细胞组(P < 0.05);各组CD4值之间、CD4/CD8值之间比较,差异无显著性意义(P > 0.05).经Kinectin-麦芽糖结合蛋白融合蛋白致敏的树突状细胞能有效刺激自体CD8+ T淋巴细胞的增殖,Kinectin-麦芽糖结合蛋白作为肝癌相关抗原可通过致敏树突状细胞发挥较明显的抗肿瘤功能.     

经kinectin融合蛋白刺激的人B细胞诱导效应T细胞对肝癌细胞的杀伤

目的:探讨经人动力素(kinectin)融合蛋白刺激的人外周血B细胞诱导效应T细胞杀伤肝癌细胞的效果.方法:取健康人外周血,分离出单个核细胞,加B细胞刺激因子及kinectin麦芽糖融合蛋白进行体外培养,尔后用尼龙毛柱分离T细胞,将其与肝癌细胞株7404混合培养.用乳酸脱氢酶法检测杀伤肝癌细胞的活性.结果:T细胞对肝癌细胞的杀伤率:空白对照组:3.40%±0.27%;实验组:38.48%±2.64%;阴性对照组:13.03%±2.38%.经统计软件分析,实验组杀伤率与其他组有明显差异.结论:经kinectin融合蛋白刺激的人外周血B细胞诱导的效应T细胞在体外对肝癌细胞株7404有杀伤的作用.     

GCF2基因片段原核表达载体的构建与鉴定

目的 构建肝癌相关抗原GCF2基因片断(323～1 234 bp)原核表达重组质粒.方法 提取人肝癌组织总RNA,通过反转录酶合成cDNA;根据GenBank公布的GCF2基因cDNA序列设计引物,利用RT-PCR法扩增出人GCF2基因片断(编号2-5a),将此片段连接在克隆载体pGEM-T上进行测序,通过酶切、连接将...     

肝癌相关抗原Kinectin蛋白致敏树突状细胞诱导的CTL对肝癌细胞株杀伤作用的检测

目的 探讨肝癌相关抗原Kinectin基因重组蛋白Kinectin-MBP(MBP,麦芽糖结合蛋白)致敏树突状细胞(DCs)体外诱导特异性细胞毒T淋巴细胞(CTL)对肝癌细胞株的杀伤作用.方法 体外基因工程的方法表达、纯化Kinectin-MBP.从正常人外周血中分离单个核细胞(PBMC),重组人粒细胞-巨噬细胞集落因子(rhGM-CSF)、重组人白细胞介素4(rhIL-4)联合培养,诱导扩增DCs,并通过形态学、流式细胞术鉴定DCs.DCs经Kinectin-MBP致敏后,ELISA检测细胞上清液中IL-12和IFN-γ的含量;将致敏DCs与自体T淋巴细胞混合培养后,MTT法检测T细胞增殖的能力;同时诱导T细胞增殖转化为CTL,以此CTL为效应细胞,Kinectin表达阳性的肝癌细胞株bel-7404为靶细胞,LDH 4 h释放法检测CTL对肝癌细胞株的杀伤作用.结果 体外重组蛋白技术成功表达、纯化出Kinectin-MBP.PBMC经rhGM-CSF和rhIL-4联合诱导,可成功培养出DCs.DCs经Kinectin-MBP致敏后上清液中IL-12和IFN-γ的分泌量明显增高,且刺激自体T细胞增殖的能力也显著增强;同时Kinectin-MBP致敏的DCs能明显诱导CTL的增殖,此CTL对Kinectin阳性的7404肝癌细胞株有较明显的杀伤作用,其杀伤率在效靶比为25∶1时达最高峰[为(65.00±1.47 )％],显著高于其他对照组(均P ＜0.001).结论 体外诱导扩增的DCs经肝癌相关抗原Kinectin-MBP致敏后具有较强的刺激自体T细胞增殖的能力,且在体外可诱导同种CTL产生和增殖,后者对Kinectin阳性的7404肝癌细胞株具有较强的杀伤效应.该实验为将Kinectin蛋白运用于以DCs为基础的肝癌临床免疫治疗奠定了基础.     

CDC25C表达下调的黑色素瘤细胞线粒体应激反应和线粒体途径凋亡情况观察

目的 探讨细胞分裂周期蛋白25C(CDC25C)对黑色素瘤B16细胞线粒体应激反应和线粒体途径凋亡的影响。方法 取黑色素瘤B16细胞进行培养,将细胞随机分为转染组、转染对照组、空白对照组。转染组转染CDC25C低表达慢病毒质粒,转染对照组转染慢病毒空质粒,空白对照组正常培养。利用Rhod-2/AM与MitoSOX荧光探针检测细胞线粒体内Ca²⁺浓度及线粒体活性氧(ROS),RT-qPCR法和Western blotting法分别检测细胞线粒体应激反应相关分子ClpP、LONP1及线粒体途径凋亡相关分子Caspase-9、Caspase-3 mRNA和蛋白表达。结果 与转染对照组和空白对照组相比,转染组细胞线粒体Ca²⁺及ROS含量增加,ClpP、LONP1、Caspase-9、Caspase-3 mRNA及蛋白表达水平升高(P<0.05或<0.01)。结论 CDC25C表达下调激活黑色素瘤B16细胞发生线粒体应激反应,并诱导线粒体途径的细胞凋亡。