HER2基因RNA干扰质粒对SK-BR-3细胞增殖及凋亡的影响

目的探讨HER2基因高效RNA干扰质粒转染到SK-BR-3乳腺癌细胞后,对细胞的增殖及其凋亡的影响。方法采用脂质体转染法将针对HER2基因的高效RNA干扰质粒转染至乳腺癌细胞SK-BR-3中,通过细胞计数、MTT比色法、流式细胞术和Western blot检测PCNA增殖细胞核抗原,分析检测其对SK-BR-3细胞增殖、凋亡的影响。结果 MTT比色测定显示,HER2-shRNA2干扰质粒转染到SK-BR-3细胞后在48 h后现抑制,与空白对照组比抑制率分别为48 h 16.53%7、2h 39.03%9、6h 65.47%。流式细胞分析HER2-shRNA组细胞在96 h凋亡率达17.36%,明显高于阴性对照组的1.41%和空白对照组的1.25%（P〈0.05）。结论将RNA干扰质粒HER2-shRNA2转染至SK-BR-3细胞中,可特异性地抑制SK-BR-3细胞的增殖并诱导其凋亡,为乳腺癌的靶向治疗奠定了基础。     

静脉泵注右美托咪定联合罗哌卡因切口浸润在小儿腹腔镜手术中的应用

目的 观察右美托咪定联合罗哌卡因切口浸润在小儿腹腔镜手术中的应用效果。方法 选取2017年1月—2018年1月安徽医科大学附属安庆医院行腹腔镜手术患儿120例,采用随机数字表法分为A、B、C 3组,每组40例。A组为对照组,关闭气腹前静脉推注芬太尼1.0 μg/kg;B组术毕用0.25%罗哌卡因浸润切口;C组麻醉诱导前静脉泵注右美托咪定0.4 μg/kg,术毕用0.25%罗哌卡因浸润切口。记录3组患儿术中麻醉药物的用量,苏醒期躁动发生率,麻醉后恢复室（PACU）停留时间,以及术后4 h、8 h、12 h、24 h、48 h NRS评分、围术期并发症的发生率、住院时间、家长满意度。结果 与A、B两组比较,C组患儿苏醒期躁动发生率明显降低,家长满意度明显提高（P <0.05）;与A组比较,B、C两组术后4 h、8 h、12 h NRS评分降低（P <0.05）;3组患儿PACU停留时间、住院时间及围术期并发症发生率比较,差异无统计学意义（P >0.05）。结论 静脉输注右美托咪定联合罗哌卡因切口浸润可降低小儿腹腔镜术后苏醒期躁动发生率,减轻患儿术后疼痛,提高家长满意度。     

人热休克蛋白110在毕赤酵母中的表达及鉴定

目的在毕赤酵母（Pichia pastoris）中高效表达人热休克蛋白110（hHSP110）,制备具有与天然hHSP110相同生物活性的重组人HSP110（rhHSP110）。方法用PCR法自质粒pBacPAK中克隆hHSP110的DNA,构建真核表达载体pPICZα/hHSP110。经核酸测序确证后,电转化毕赤酵母菌株X-33。用PCR法筛选Zeocin抗性的转染阳性克隆,用Western blot法鉴定甲醇诱导的培养上清液中的rhHSP110,筛选高表达工程菌。结果经PCR法克隆的hHSP110DNA序列与GeneBank登录的cDNA序列一致。将hHSP110DNA定向插入pPICZα,构建pPICZα/hHSP110真核表达载体并经电转化获得Zeocin抗性的阳性克隆。SDS-PAGE和Western blot分析显示了甲醇诱导的培养基上清中含有rhHSP110。rhHSP110表达量达120mg/L。结论克隆hHSP110基因并构建和筛选出高效表达rhHSP110的毕赤酵母工程菌,表达的rhHSP110具有天然rhHSP110相同的生物活性。     

shRNA基因沉默靶向治疗对乳腺癌细胞HER2表达的影响

目的 构建针对HER2基因RNA干扰的真核表达载体并筛选出HER2基因的高效RNA干扰序列.方法 采用化学合成方法合成三段针对HER2基因的shRNA,通过酶切连接方法与真核表达载体pSuper/GFP/neo相连接,构建针对HER2基因的RNA干扰载体,并通过酶切和测序方法鉴定是否含有设计的shRNA.应用脂质体转染试剂分别转染载体到人乳腺癌SK-BR-3细胞中,采用实时定量PCR和Western印迹检测其对HER2基因沉默的效果.结果 EcoRⅠ和HindⅢ进行双酶切鉴定,281 bp条带出现,证明质粒中插入外源基因,再经测序证实含有设计的shRNA序列.实时定量PCR和Western印迹结果显示3段shRNA均可降低HER2 mRNA的水平并且降低跨膜蛋白HER2的表达,其中shRNA2的HER2 mRNA抑制效率最高,达到89%.结论 构建了3个真核表达载体pSuper/GFP/neo-HER2,并筛选出shRNA2这段序列,可以有效沉默人乳腺癌细胞系SK-BR-3 的HER2基因,为乳腺癌的HER2基因沉默靶向治疗奠定了基础.     

重组人HER2/neu ICD在毕赤酵母中的表达及鉴定

目的 用毕赤酵母表达体系制备具有与天然HER2/neu ICD相同结构和活性的重组HER2/neu ICD.方法 PCR法自质粒pCMV中克隆HER2/neu ICD基因,构建真核表达载体pPICZα/HER2/neu ICD,电转化至毕赤酵母菌株X-33.对基因转染Zeocin抗性阳性的克隆,采用PCR法筛选出稳定表达HER2/neu ICD的菌株.最后用SDS-PAGE鉴定甲醇诱导的培养上清液中的HER2/neu ICD.结果 构建pPICZα/HER2/neu ICD真核表达载体并经电转化获得Zeocin抗性阳性的克隆;PCR法筛选了稳定表达HER2/neu ICD的菌株;SDS-PAGE分析显示甲醇诱导后表达上清中含有HER2/neu ICD,分子量约为84 kDa.结论 成功构建pPICZα/HER2/neu ICD真核表达载体并筛选出稳定表达HER2/neu ICD的毕赤酵母工程菌.     

肱骨干骨折60例治疗分析

肱骨干是指肱骨外科颈以下至肱骨内、外上髁以上部位。肱骨干骨折临床较常见,约占全身骨折总数的1.31%。多为直接暴力所致,亦可由间接暴力引起。本文收集本院收治的肱骨干骨折病例60例,对其治疗方法及疗效进行分析和探讨。1资料与方法1.1一般资料:60例中男42例,女18例;年龄在14～72岁之间。左侧25例,右侧35例;上段4例,中段30例,下段26例;车祸伤32例,打击伤15例,摔伤4例,高处坠落伤4例,其他5例。60例均为闭合性骨折。合并桡神经损伤者3例,无血管损伤。伤后至治疗时间最短为3小时,最长为48小时。所有病人均随访,随访时间为2～10个月,平均随访…     

角膜缘干细胞缺乏动物病理模型的建立

目的：研究角膜缘干细胞缺乏动物模型建立的方法，为组织工程角膜上皮的损伤移植研究奠定动物病理模型基础。方法： 利用角膜缘上皮全周板层手术将实验动物兔右眼角膜缘后5 mm，环绕角膜缘全周将球结膜剪开，将全板层角膜及角膜缘外5 mm的球结膜组织一同剪去，用刮刀刮去角膜上皮层。术后7、14、28 d做裂隙灯检测、荧光素染色检查、PAS检测、照相，观察角膜上皮的混浊及血管化程度以确定动物模型是否成功。结果：手术1 d后实验兔右眼结膜红肿，眼睑轻度肿胀；3 d后生成红色肉芽组织，并伴随细小血管增生。7 d后荧光素染色阳性，角膜缘全周细小血管向角膜中央逐渐长入。14 d后长入角膜的结膜组织覆盖角膜。28 d后细胞印迹学检查核/浆体积比为1∶4～1∶5 ，PAS染色呈阳性,成功建立角膜缘干细胞完全缺失的病理模型。结论:可通过手术法代替化学法建立角膜缘干细胞缺乏动物病理模型，本研究为角膜病的治疗奠定了实验学基础。     

高特异性HER-2/neu肽疫苗的实验研究

目的　设计并制备显著激活细胞毒性 T细胞 (CTL)的高特异性 HER- 2 / neu肽疫苗 ,并对其进行活性实验研究。方法　根据 T site蛋白质分析软件模拟的 HER- 2 / neu空间构象 ,选取、合成 2种与 MHC- I类分子高亲和性的区段 P4 2 - 50 、P782 - 790 并对其进行修饰。建立 BALB/ c小鼠的乳腺癌模型 ,用上述多肽作疫苗、GM- CSF做佐剂 ,免疫小鼠 ,分别应用 MTT法、EL ISPOT法、颗粒酶释放法测定 T细胞的增殖 ,T细胞分泌 IFN-γ,CTL对肿瘤细胞的杀伤活性。结果　经修饰的 HER- 2 / neu多肽疫苗可促进 T细胞增殖 ,促进 T细胞分泌 IFN-γ及 CTL杀伤乳腺癌细胞。结论　经修饰过的 HER- 2 / neu多肽疫苗可显著激活细胞免疫 ,增加对乳腺癌细胞的杀伤作用。     

人HER2/neu胞外区在毕赤酵母中的表达及鉴定

目的在毕赤酵母中高效表达HER2／neu胞外区，制备具有与天然HER2／neu相同结构和生物学活性的重组人HER2／neu胞外区（rhHER2／neu ECD）。方法用RT-PCB法自人mBNA中克隆her2／neu ECD基因，构建真核表达载体pPICZα/her2/neu ECD。经核酸测序确证后，电转化毕赤酵母菌株X-33。用PCB法筛选基因转染后Zeocin抗性阳性的克隆，用SDS-PAGE法筛选高表达HER2／neu ECD工程菌，用Western印迹法鉴定甲醇诱导的培养上清液中的HER2／neu ECD。结果经BT-PCB法克隆的her2／neu ECD基因序列与GenBank登录的cDNA序列一致。将her2／neu ECD基因定向插入pPICZα，构建pPICZα/her2/neu ECD真核表达载体，经电转化获得Zeocin抗性阳性的克隆。SDS-PAGE和Western印迹法分析证实了甲醇诱导的培养基上清中含有HER2／neu ECD，分子量110kDa。HER2／neu ECD表达量达120mg／L。结论克隆her2／neu ECD基因并构建和筛选出高效表达HER2／neu ECD的毕赤酵母工程菌。     

Klotho基因转染促进脂肪间充质干细胞增殖的实验研究

目的探讨klotho基因转染对脂肪间充质干细胞(ADSCs)增殖的影响。方法将含有klotho全长基因的真核质粒转染至从脂肪组织分离的ADSCs中,采用CCK-8法测定转染后细胞增殖率,western blot法检测转染后细胞周期蛋白D1的表达变化,流式细胞术检测转染前后ADSCs的细胞周期变化。结果转染klotho基因96h后AD-SCs的细胞增殖率为170.50%;流式细胞术检测结果显示,ADSCs转染klotho基因S期和G2期细胞明显增多;west-ern blot分析显示ADSCs转染klotho基因组细胞周期蛋白D1增高。结论转染klotho基因有促进ADSCs增殖的作用。