我国新发现的鼠疫自然疫源地鼠疫菌基因组序列测定及分析

目的 测定和分析我国新发现的鼠疫自然疫源地鼠疫菌株（耶尔森菌）的全基因组序列,探讨玉龙疫情菌株(D106004)与邻近两个疫源地剑川菌株(D182038)和西藏菌株(Z176003)的亲缘关系。方法 采用全基因鸟枪法及Solexa方法对3株鼠疫菌株进行全基因组测序,并进行比较基因组学分析。基因组间编码序列比较分析采用BLAST软件进行,基因组间重排分析采用MAUVE软件进行。结果 鼠疫菌株D106004、D 182038、Z176003均具有1个染色体和3个质粒,菌株间染色体、质粒特征基本相似;3株菌株间编码序列的蛋白相邻类的聚簇(COG)功能分类及插入序列数目比较差异无统计学意义(x2值分别为3.03、0.257,P均＞0.05)。菌株间编码序列、单核苷酸多态性(SNPs)和基因组重排结果显示,在3株菌株中,有2882个基因具有100％的同源性。其中D106004菌株预测的3636个基因中与D182038菌株一致的基因有2994个,90％以上相似的基因有240个;与Z176003菌株一致的基因有3113个,90％以上相似的基因有200个;D106004菌株与Z176003、D182038菌株的同义SNPs数为59、68个,非同义SNPs数为104、203个;D106004与Z176003菌株之间可分为11个重排片段,较之D106004与D182038菌株之间的16个重排片段数目明显减少。结论 3株鼠疫菌株基因之间具有高度同源性,D106004与Z176003菌株之间的亲缘关系较之与D182038菌株更为接近,玉龙疫源地菌株可能是由西藏疫源地菌株进化而来。     

猴血SV40抗体和SV40 DNA携带关系分析

目的　检测 5 7份恒河猴血清及对应的猴血中抗SV4 0抗体、SV4 0DNA的携带情况 ,找出抗体滴度与DNA携带的相关关系。方法　用间接免疫荧光法检测猴血中SV4 0中和抗体 ,聚合酶链反应 (PCR)法检测SV4 0st抗原DNA的携带情况。结果　 5 7份猴血清中 ,SV4 0抗体阳性率为 93% (5 3 5 7) ,抗体滴度最高为 1∶12 80 ,最低为 1∶10 ,GMT为 15 9.5 6 ,PCR检测猴血淋巴细胞SV4 0DNA阳性率为 2 4 .5 6 % (14 5 7) ,当抗体为 1 80以下时 ,病毒整合于血细胞 ,1∶80以上时 ,对st抗原基因的整合有抑制作用。结论　恒河猴SV4 0DNA的携带情况与抗体阳性和滴度呈反相关     

甲型肝炎减毒活疫苗免疫小鼠后的体液和细胞免疫应答

减毒活疫苗进入体内在增殖的过程中，可以刺激T淋巴细胞分化，产生细胞免疫；使用甲型肝炎减毒活疫苗后发现，诱发的抗体阳转率往往低于疫苗保护率，推测疫苗引起的抗体应答是疫苗保护机制的一部分，而另外重要的一部分应该是细胞免疫。本研究拟在检测抗体反应的同时，观察疫苗免疫后T淋巴细胞免疫应答，探讨接种甲型肝炎减毒活疫苗后产生免疫保护的机制。     

甲型肝炎灭活疫苗(L-8株)口服及腹腔注射Bal b/c小鼠的免疫反应评价

目的　比较评价甲型肝炎(甲肝)灭活疫苗(L 8株)不同途径接种Balb/c小鼠所诱导产生的免疫效应。方法将32 0EU/0 5ml的实验疫苗1次口服及腹腔注射免疫实验动物,于2周、4周时收集血液样本,用酶联免疫吸附试验(ELISA)方法检测抗体反应,同时动态检测免疫小鼠外周血T淋巴细胞亚群及肿瘤坏死因子(TNF) α、干扰素(IFN) γ。结果　不论是腹腔注射或是口服免疫均能诱导产生良好有效的体液免疫效应。腹腔免疫后CD+ 4 T细胞百分比轻微下降,而CD+ 8T细胞百分比上升趋势及幅度明显,CD+ 4 /CD+ 8比值明显下降;而口服免疫小鼠外周血CD+ 4 T细胞百分比持续上升,CD+ 8T细胞百分比亦同步升高,两者上升幅度基本一致,CD+ 4 /CD+ 8比值无明显改变。另外,两种途径免疫接种均可诱导产生高滴度的内源性IFN γ。结论　有必要对甲肝灭活疫苗口服免疫的机制及其开发利用作进一步的研究。     

独山瓜馥木总生物碱抗结核活性初探

目的 系统评价独山瓜馥木二氯甲烷提取物3种组分的抗结核作用。方法 采用抗结核活性跟踪法,从独山瓜馥木根中分步提取具有抗结核活性的组分,并采用Alarmar-Blue液体药敏法进行体外抗结核活性的评价。结果 从独山瓜馥木根中获得了具有抗结核活性的二氯甲烷提取物(组分1)。薄层层析定性分析为总生物碱,进一步分离纯化得到组分2和3。药敏结果显示组分1和组分2对异烟肼和利福平的单耐药及耐多药结核分枝杆菌均有明显的抑制作用,尤其是组分2,对3/4的耐多药菌株的最小抑菌浓度小于40 μg/mL。结论 在当前耐药结核病流行的严峻形势下,独山瓜馥木提取物有治疗单耐和耐多药结核病的研发前景,其有效成分及抗结核机制有待进一步研究。     

利用串联重复序列研究炭疽芽胞杆菌的基因分型

目的 应用基因组中多位点串联重复序列遗传标记对不同地区88株炭疽芽胞杆菌进行基因分型。方法炭疽芽胞杆菌染色体DNA基因组中存在着串联重复序列。在串联重复序列两侧设计引物，PCR扩增，琼脂糖和聚丙烯酰胺凝胶电泳，凝胶影像分析软件对PCR扩增产物碱基含量进行测算，并与测序结果进行比较，计算出串联重复拷贝数，对拷贝数进行聚类分析。结果 （1）聚类分析发现，88株菌株可分为三大群，45个基因型，基因型与生态环境存在一定的关系。就某一地区炭疽暴发而言，其可变数目串联重复序列遗传标记具有相似性。（2）研究发现，A16R疫苗株作为中国的疫苗株具有代表性。结论 炭疽芽胞杆菌基因组中的串联重复序列具有遗传稳定性和特异性，可作为炭疽芽胞杆菌基因分型的指标，在炭疽暴发和生物恐怖事件中的病原体溯源上具有重要的意义。     

2种口服甲型肝炎疫苗免疫应答效果评价

目的 研究甲型肝炎减毒活疫苗和灭活疫苗口服免疫效果。方法 将甲型肝炎减毒活疫苗和灭活疫苗口服免疫Balb／c小鼠，并检测免疫后抗甲型肝炎总抗体、IgA和sIgA，外周血淋巴细胞亚群，脾淋巴细胞增殖反应和细胞因子干扰素-γ（IFN-γ），肿瘤坏死因子-α（TNF-α）和白细胞介素2（IL-2）水平。结果 2种疫苗口服免疫后均能诱导体液、细胞和局部免疫应答；但含铝佐剂的甲型肝炎灭活疫苗口服免疫，诱导抗体水平较低，但可诱导较好的细胞免疫应答。结论 口服免疫可以作为甲型肝炎疫苗有效的免疫途径之一。     

炭疽芽胞杆菌基因组中串联重复序列拷贝数的分析

目的研究炭疽芽胞杆菌基因组中多位点串联重复序列遗传标记的遗传变异规律。方法根据文献上发表的串联重复序列位点，利用已发表的13对引物，对88株炭疽芽胞杆菌基因组DNA进行PCR扩增，扩增产物进行琼脂糖和聚丙烯酰胺凝胶电泳，利用凝胶影像分析软件对PCR产物DNA片段的碱基含量进行测算，计算出串联重复拷贝数。对部分PCR扩增产物DNA片段进行测序，利用DNAStar软件进行序列比对，分析不同菌株间的串联重复序列遗传变异规律。结果（1）炭疽芽胞杆菌基因组中的串联重复序列位置，同一菌株具有相对稳定的串联重复拷贝数。（2）88株炭疽芽胞杆菌DNA上的13个串联重复序列遗传标记中，有的串联重复序列拷贝数变异较小，有的却存在着复杂的多态性；（3）有些串联重复序列单位内的核苷酸数目不变，但核苷酸的排列组合有差异，不过其重复单位内都包含着一个相同的稳定不变的核心核苷酸序列。结论炭疽芽胞杆菌基因组DNA中串联重复序列可以精确定位，测定结果可以数值化，并且串联重复序列在菌株DNA中具有相对的稳定性，因此，串联重复序列是研究炭疽芽胞杆菌遗传特征的较好指标，具有鉴别炭疽芽胞杆菌菌株间差别的能力。     

1998至2001年四川省霍乱流行中6b型菌株的分子特征

目的 分析1998-2001年四川省霍乱流行中噬菌体-生物分型为6b的特殊菌型霍乱弧菌的分子特征.方法 选择1998-2001年四川省01群霍乱弧菌流行菌株以及同时期其他省份的流行菌株共45株,进行噬菌体-生物分型、脉冲场凝胶电泳(PFGE)分析以及突变基因的序列测定比较.结果 四川在1998-2001年期间流行的菌株存在1b型和6b型菌株,这些菌株均为产毒株;PFGE分析结果显示菌株呈现24种带型,其中13株菌表现为相同带型;来自四川的部分1b和6b型菌株以及部分其他省份的1b型菌株具有相同的PFGE带型;与1b型菌株相比,6b型菌株(共22株)的ompW基因ORF内存在11 bp缺失,而其余23株菌非6b型菌株的ompW基因ORF是完整的.结论 1998-2001年四川流行的O1群霍乱弧菌6b菌株是一类具有特殊遗传背景的菌型,可能与同期流行的1b型菌株有进化上的关联.     

鼠疫耶尔森菌rRNA基因识别特征研究

目的 分析鼠疫耶尔森菌(鼠疫菌)的rRNA基因识别特征.方法 通过比较基因组学方法,利用Clustal W软件,对目前已完成全基因组测序的9株鼠疫菌的rRNA基因序列进行分析,分别比对rRNA基因簇两侧的2000bp序列、基因簇内16S、23S、5S rRNA及16S～23S基因间隔区序列,以确定鼠疫菌rRNA基因的识别特征.结果 菌株D182038、D106004、Z176003和CO92分别有6个rRNA基因簇拷贝(6拷贝菌株),菌株91001、KIM、Nepa1516、Antiqua和Pestoides F分别有7个rRNA基因簇拷贝(7拷贝菌株).按照两侧2000bp序列不同,可将鼠疫菌rRNA基因簇分成13种类型,并可将6拷贝与7拷贝菌株进行区分;16S～23S rRNA基因间隔区含有4种不同种类和数量的tRNA基因,可将6拷贝菌株和7拷贝菌株分别进行区分;23S rRNA基因在不同菌株间及不同rRNA拷贝间的碱基突变数方差分析显示,各菌株间F=0.548,P=0.815>0.05;各拷贝间F=5.228,P<0.01.结论 鼠疫菌rRNA基因簇两侧序列、间隔区tRNA基因和23S rRNA基因可作为识别不同菌株和不同rRNA基因簇拷贝的指标,将鼠疫菌不同菌株进行分类.

Abstract：

Objective To study the identification characteristics of rRNA genes on Yersinia (Y.)pestis.Methods By means of comparative genomics,we compared the rRNA genome sequences of nine completely sequenced strains of Y. pestis isolated from China and other countries by Clustal W software.we also compared the 2000 bp sequence adjacent to the rRNA genes,rRNA genes and 16S-23S rRNA spacer region respectively to determine the identification features of rRNA genes for Y. pestis.Results There were 6 rRNA gene clusters in the strains of D182038,D106004,Z176003 and CO92 respectively(6 copies strain).There were 7 rRNA gene clusters in the strains of 91001,KIM,Nepa1516,Antiqua and Pestoides F(7 copies strain).According to the 2000 bp sequence,13 types of rRNA gene clusters could classify the strains between the 6 copies and 7 copies.There were 4 types of tRNA gene among the 16S-23S rRNA spacer region that could classify the strains among the 6 copies and 7 copies strains respectively.The number of point mutation among the 23S rRNA gene was statistically different in some copies under ANOVA analysis(F=0.548,P=0.815>0.05 among the strains and F=5.228,P<0.01 among the copies).Conclusion The 2000 bp sequence adjacent to the rRNA genes,tRNA gene and 23S rRNA gene sequence could serve as the identification sign of rRNA genes for classifing the strains of Y. pestis.