悬滴培养诱导大鼠骨髓间充质干细胞分化为肝样细胞

目的: 与平板培养比较,探讨悬滴三维培养对大鼠骨髓间充质干细胞(rMSCs)肝样分化的诱导效应。方法: 对rMSCs进行悬滴培养,以肝细胞生长因子(HGF)作为诱导因子,同时设定平板培养诱导和非诱导对照组,在培养第7、14和21 d后,通过RT-PCR法和免疫荧光技术检测白蛋白(ALB)、甲胎蛋白(APF)和角蛋白(CK-18)在mRNA和蛋白水平上的表达情况,并通过ELISA检测培养液上清中ALB的分泌。结果: HGF悬滴培养的rMSCs形成球状三维结构,内部呈现空囊样结构,大量细胞聚集在球体外侧面;在第7 d就出现ALB和CK-18的强阳性表达,而AFP则表达较弱。HGF培养的单层rMSCs直到第14 d才出现ALB、AFP和CK-18 mRNA的弱阳性表达,蛋白表达则在第21 d才呈现阳性。ELISA检测到HGF悬滴培养后rMSCs能够胞外分泌ALB,与正常和平板培养诱导组比较差异显著(P<0.01)。结论: 悬滴培养为rMSCs创造一种球形三维培养微环境,在HGF的诱导作用下,rMSCs横向分化为肝样细胞。     

甘氨酸对心肌缺血-再灌注小鼠一氧化氮系统和Bcl-2 mRNA表达的影响

目的:探讨甘氨酸(Gly)对心肌缺血-再灌注(MI/R)损伤的防治作用及机制,为临床缺血性心脏病的防治提供新的思路与方法。方法: 将小鼠随机分为5组,以Gly等药物定量灌胃处理。1周后,腹腔注射垂体后叶素和硝酸甘油复制MI/R模型,同时记录不同时点的肢体Ⅱ导联心电图。4 h后,分别用比色法和硝酸还原酶法检测小鼠心肌组织中一氧化氮合酶(NOS)、诱导型一氧化氮合酶的活性(iNOS)和一氧化氮(NO)的含量;用逆转录-多聚酶链式反应(RT-PCR)测定各组小鼠心肌组织Bcl-2 mRNA的表达。结果: MI/R组小鼠心电图J点发生明显偏移。 Gly预处理组小鼠心肌组织总NOS活性、NO含量及Bcl-2 mRNA的表达显著升高,而iNOS的活性显著下降。结论: Gly能保护心脏,减轻MI/R引发的损伤。Gly的这一作用可能与其增加缺血再灌注心肌组织中NOS的活性及NO的生成,抑制iNOS的活性,以及促进Bcl-2 mRNA的表达有关。     

二甲磺基乙烷处理生精小管体外培养模型的建立

目的建立二甲磺基乙烷(EDS)处理生精小管的体外培养模型。方法雄性SD大鼠于实验前7 d腹腔注射EDS,分离生精小管进行体外培养,分为基础处理组(加入胰岛素-转铁蛋白-亚硒酸钠培养基添加剂ITS,即ITS组)和促黄体素(LH)处理组(加入ITS和LH,即ITS+LH组),采用Ed U标记技术检测睾丸间质干细胞增殖情况,放射免疫分析技术及3β-HSD染色检测睾酮分泌及睾丸间质干细胞的分化情况。取雄性成年小鼠睾丸并分离生精小管,分别以不同浓度的EDS处理,其后再进行分组(ITS组和ITS+LH组)处理连续培养,采用放射免疫法检测培养基上清液中睾酮的分泌情况。结果与ITS组比较,大鼠生精小管ITS+LH组睾丸间质干细胞增殖较为明显。睾酮的分泌呈现与体内睾丸间质细胞发育分化趋势一致;且该模型在LH作用下,睾酮产生量大,持续时间长,表明该模型对LH敏感。1.72 mmol/L EDS可有效杀死小鼠生精小管上的成熟睾丸间质细胞;该处理模型在经过培养后又有睾酮的产生,且ITS+LH组生精小管培养上清液中睾酮含量显著高于ITS组(P<0.01),表明EDS可以杀死成熟睾丸间质细胞,同样该模型也表现出对LH敏感。结论雄性大鼠和小鼠生精小管体外培养模型中,睾丸间质干细胞的发育分化过程与体内睾丸间质干细胞的发育分化相似,该模型是一个研究睾丸间质细胞发育分化的合适模型。     

人胰淀素类似物普兰林肽体外活性测定方法的建立

建立体外人胰淀素类似物普兰林肽活性测定的方法,为普兰林肽及其制剂的质量控制提供可靠的细胞检测方法。将L6细胞培养并分化成有明显肌管的成熟骨骼肌细胞,采用葡萄糖氧化酶-过氧化物酶法(GOD-POD)检测普兰林肽对高糖培养环境下骨骼肌细胞葡萄糖吸收的影响。结果显示,在1×10-9～1×10-5mol/L的浓度范围内,普兰林肽能显著增加分化后的L6细胞的糖吸收量,在16 h达到最大值。普兰林肽浓度的负对数(x)与细胞糖吸收增加量(y)间呈现出良好的线性关系(y=-4.750x+59.54,R2=0.991 9)。应用本实验建立的方法检测了市售普兰林肽醋酸盐注射剂的活性,结果显示1×10-6、1×10-7和1×10-8mol/L的普兰林肽注射剂作用于分化的L6细胞16 h,细胞的糖吸收增加率为(61.89±9.54)%,(43.68±10.06)%和(33.30±13.03)%(P<0.01);与单用胰岛素组对比,普兰林肽与胰岛素联合使用能显著提高分化后的L6细胞的糖吸收量(P<0.05),与普兰林肽注射剂的临床使用结果一致。本实验为普兰林肽的活性测定提供了一种稳定可靠的细胞替代模型。     

铅对睾丸间质瘤细胞孕酮合成能力的影响北大核心CSCD

目的通过检测孕酮合成相关酶的基因表达水平探讨重金属铅对睾丸间质瘤细胞的毒理作用,为揭示重金属导致男性性功能低下的毒性作用机制提供实验依据。方法采用睾丸间质细胞的肿瘤细胞株R2C作为受试对象,暴露于含重金属铅的无血清培养环境,在1、3、6、12和24 h测定细胞活性,收集细胞上清液,利用放射免疫法,检测孕酮合成的变化;应用RT-RCR的方法观察孕酮合成相关酶在基因水平上的表达差异。结果通过CCK-8检测发现,100μmol/L重金属铅作用于R2C细胞12和24 h后,细胞存活率未显著降低(P>0.05);放射免疫检测各个时间点孕酮的变化发现,12和24 h能够显著降低孕酮的合成(P<0.05)。细胞暴露于含铅培养基后,尽管在作用12和24 h后类固醇激素合成酶基因水平的表达都基本恢复到正常水平,但是在铅暴露3 h后,St AR、P450scc基因的表达显著降低(P<0.05),6 h后St AR基因的表达降低更明显(P<0.01)。结论重金属铅能够抑制R2C细胞合成孕酮的功能,主要通过下调孕酮合成通路中胆固醇转运酶St AR和限速酶P450scc的基因表达水平发挥作用。     

不同进食量对小鼠功能活动和生化指标的影响

目的:探讨不同进食量在不同时间内对小鼠体重、记忆力、平衡耐力和相应生化指标的影响。方法:预先计算小鼠每天平均进食量,按照100%食量,75％食量、50％食量、25％食量及0％食量分为A、B、C、D、E组。实验过程中每3d测试记忆力、平衡耐力和体重1次,第10d取血检测相应生化指标。结果:实验第3d,E组体重、平衡耐力下降;实验第6d和第9d,A组、B组、C组体重明显上升,A组、D组动物的记忆力低于B组和C组;实验第10d,D组血糖显著下降,总胆固醇及甘油三酯随进食量的减少而显著下降。结论:适度减少进食量能维持正常体力和血糖水平,保持良好的记忆力,并有助于降低血中总胆固醇和甘油三酯。     

一种新型转铁蛋白受体结合肽的筛选与鉴定

目的以转铁蛋白受体(TfR)为靶标,从噬菌体随机七肽库淘选TfR结合肽并进行鉴定。方法经过三轮筛选,从平板上挑取分隔良好的特异性TfR结合肽单克隆,采用ELISA初步鉴定后行扩增测序及多肽合成,采用流式细胞仪检测人肝癌HepG2细胞表面TfR表达、采用免疫荧光实验及激光共聚焦实验行噬菌体与细胞共定位鉴定、采用短肽—噬菌体竞争抑制实验检测短肽对噬菌体的竞争抑制率,以正常肝脏L-O2细胞为对照。结果特异性TfR结合肽克隆最终富集度达80倍;初步检测到20个阳性克隆,其中9号克隆对TfR亲和力最高,测序表明其展示短肽序列为AHLHNRS,以碱性氨基酸为主,经HPLC检测纯度为99.91%;HepG2细胞表面TfR表达显著高于L-O2细胞;免疫荧光实验及激光共聚焦实验均显示9号噬菌体(P9)出现在HepG2细胞表面,而对照L-O2细胞无此现象;短肽与噬菌体P9对TfR的结合存在竞争关系,并且呈浓度依赖性,而野生型噬菌体M13与L-O2不存在此现象。结论本研究获得一条与TfR具有特异性结合能力的TfR结合肽;此为进一步构建肿瘤和脑源性疾病靶向治疗药物奠定了基础。     

HSP27作为评价皮肤急性刺激性生物标志物的研究*

 目的：应用蛋白组学技术筛选用于评价化合物皮肤急性刺激性的特异性生物标志物。方法：选取2种欧盟列举的具有代表性的皮肤刺激性化合物十二烷基硫酸钠（SLS）、10-十一碳烯酸（UA）和1种非刺激性化合物3,3-二硫代二丙酸（DA）,严格按照体外评价皮肤刺激性替代方法的检测流程,使人体皮肤组织暴露于化合物15 min,然后裂解组织,提取蛋白,进行二维电泳;选择蛋白表达差异点,进行质谱鉴定,并用real-time RT-PCR和Western blotting验证差异蛋白的表达。结果：在鉴定的8个蛋白点中,SLS和UA刺激使人体皮肤热休克蛋白27（HSP27）的表达显著上调,与Western blotting结果一致。结论：HSP27有可能成为评价皮肤刺激性体外替代方法体系的候选生物标志物,其表达强度与刺激强度的关系需进一步探讨。     

haFGF突变体促细胞增殖活性降低及其机制

目的：观察N端缺失27个氨基酸残基的人酸性成纤维细胞生长因子突变体（mhaFGF）对肝癌细胞增殖活性和信号转导的影响。方法： 用不同浓度（0.01-100 μg/L）的人酸性成纤维细胞生长因子（haFGF）及mhaFGF分别处理肝癌细胞，15 min后用半定量Western blotting检测信号蛋白Grb2、Erk1/2在肝癌细胞中的表达，48 h后用MTT法检测细胞增殖活性，并用流式细胞仪分析细胞周期。结果： haFGF组G1期细胞比例显著低于和S期显著高于mhaFGF组和对照组，而mhaFGF组与对照组间无差别; mhaFGF组的Grb2和MAPK-ERk1/2信号分子表达水平低于haFGF组。结论： mhaFGF促分裂活性的下降可能是通过下调MAPK信号通路中的MAPK-ERK1/2和Grb2信号分子的表达来实现的。     

重组人角质细胞生长因子在毕赤酵母中的表达、纯化及活性测定

目的:利用巴斯德毕赤酵母(Pichiapastoris)重组表达人角质细胞生长因子(humankeratinocytegrowthfactor,hKGF),为实现规模化生产重组hKGF奠定基础。方法:根据已报道的hKGF成熟肽序列,人工合成由毕赤酵母偏好密码子组成的编码hKGF的DNA片段后连接到分泌型表达质粒pPICZαA中,获得重组表达质粒并转化毕赤酵母X-33中进行表达。优化发酵条件,并利用5L生物反应器进行中试发酵。发酵上清通过超滤及层析方法分离纯化重组蛋白,并利用MMT法检测其对恒河猴肺上皮细胞的促增殖活性。结果:在20℃,甲醇诱导60h后,获得分子量约为28kD的目的蛋白,表达量约占菌体上清总蛋白的14.1%。发酵液经肝素亲和层析和SephardexG-25分子筛分离获得纯度为95.0%以上的重组蛋白,得率为12mg/L。该重组hKGF具有糖基化修饰,能显著促进恒河猴肺上皮细胞增殖,其ED₅₀约为57μg/L。结论:利用毕赤酵母成功表达出糖基化修饰及具促恒河猴肺上皮细胞增殖活性的重组hKGF。