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结核分支杆菌Ag85B蛋白在大肠杆菌中的高效表达 总被引:4,自引:0,他引:4
目的:通过结核分支杆菌Ag85B基因在大肠杆菌中的表达,获得大量纯化的重组Ag85B(rAg85B)蛋白。方法:应用PCR技术扩增结核分支杆菌H37RvAg85B DNA序列;以质粒pET24b为表达载体,构建Ag85B重组质粒,然后转化大肠杆菌BL21(DE3);以IPTG诱导转化子,通过SDS—PAGE电泳鉴定rAg85B的表达水平,采用Novagen公司生产的His.Bind蛋白纯化试剂盒纯化rAg85B蛋白。结果:重组质粒PET24b—Ag85B测序表明与报道的序列相同;它在大肠杆菌BL21(DE3)细胞内以包涵体形式存在,表达量占菌体总蛋白的30%左右。纯化后的rAg85B样品经SDS—PAGE和光密度扫描分析表明其纯度约为95%左右,每100ml培养菌可获得10mg左右纯化的重组蛋白。结论:pET24b—Ag85B大肠杆菌工程菌株能高效表达rAg85B蛋白,大量纯化的rAg85B为其进一步的研究与应用奠定了基础。 相似文献
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目的 了解结核分支杆菌重组抗原ESAT6 (E)、MPT64 (M)、Ag85A(A)及两两混合物诱发豚鼠产生迟发型超敏 (DTH)反应的能力。方法 常规皮肤实验法 :灭活H37Rv全菌体致敏豚鼠,皮肤试验以生理盐水为阴性对照,5UPPD标准品为阳性对照,0.8μgE、0.8μgM、0.8μgA、0.4μgA+0.4μgM、0.4μgA+0.4μgE、0.4μgE+0.4μgM分别于背部皮内注射,注射后24、48、72h分别测量硬结反应横、纵直径 (mm),取二者的平均值。皮肤试验轮圈法 :生理盐水、5UPPD及0.8μgE、0.8μgM、0.8μgA、0.4μgA+0.4μgM、0.4μgA+0.4μgE、0.4μgE+0.4μgM,以轮圈法注射于同一只豚鼠背部两侧,每批6只,共3批。注射后24、48、72h分别测量硬结反应横、纵直径 (mm),取二者的平均值。结果 常规皮肤试验0.8μgM、A、M+E及E+A诱发豚鼠DTH的平均直径与PPD相比无显著性差异 (P>0.05),而0.8μgE抗原及M+A诱发豚鼠DTH的平均直径与PPD相比有显著性差异(P<0.05)。时间效应 :重组抗原及其混合物诱发豚鼠DTH的平均直径24h平均直径显著高于48h平均直径 (P<0.05),24h测量效果较好。轮圈法皮肤试验排除个体差异后,结果与常规皮肤试验结果一致。结论 从试验结果看,重组ESAT6抗原及MTP64与Ag85A混合物诱发豚鼠DTH反应强于PPD。 相似文献
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目的研究esat6-卡介苗重组疫苗、mpt64-卡介苗重组疫苗、ag85a-卡介苗重组疫苗、ag85b-卡介苗重组疫苗的免疫原性。方法通过ELISA法检测小鼠血清中特异性抗体,用MTS法分析其脾淋巴细胞增殖指数。结果以生理盐水、卡介苗为对照,用各卡介苗重组疫苗免疫小鼠后,各组小鼠体重变化与对照组相比差异无统计学意义。应用不同抗原检测各组小鼠不同时间采集的血清,各组有其特异性抗体产生;ag85a-卡介苗重组疫苗能提高卡介苗刺激B细胞产生抗体的水平;各卡介苗重组疫苗免疫后15d,抗体水平已有升高,45d时达到最高水平。用不同抗原刺激各组小鼠脾淋巴细胞,平均刺激指数均达2.0以上,esat6-卡介苗重组疫苗组小鼠脾淋巴细胞的刺激指数稍高,其它各组之间差异无统计学意义。结论结核分枝杆菌esat6、mpt64、ag85a、ag85b基因在卡介苗中都能够表达特异的蛋白,刺激小鼠产生特异性抗体,均能刺激T淋巴细胞产生细胞免疫。 相似文献
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目的评价mpt64-卡介苗重组疫苗对结核病预防效果。方法观察mpt64-卡介苗重组疫苗对结核分支杆菌感染的预防试验中实验动物半数死亡时间、一定时间内的死亡率、大体病变、T细胞及B细胞免疫功能等指标评价mpt64-卡介苗重组疫苗对结核分支杆菌的预防效果。结果用mpt64-卡介苗重组疫苗对分支杆菌感染进行预防,mpt64-卡介苗重组疫苗组及卡介苗组与生理盐水对照组比较都能延长结核分支杆菌感染小鼠的半数死亡时间,降低2个月的死亡率。结核分支杆菌攻击后2个月,处死小鼠时,mpt64-卡介苗重组疫苗组小鼠脏器与其他各组之间差异无统计学意义。各组小鼠脏器研磨、消化后稀释为不同梯度进行培养,mpt64-卡介苗重组疫苗小鼠肺结核分支杆菌生长的最低稀释度主要集中在10-5,肝、脾结核分支杆菌生长的最低稀释度主要集中在10-4。抗体检测结果及淋巴细胞增殖实验各组间差异无统计学意义。结论初步实验表明:mpt64-卡介苗重组疫苗对结核分支杆菌感染的预防作用与卡介苗差异无统计学意义。 相似文献
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目的:评价16S-23rDNA间隔区序列寡核苷酸探针碱性磷酸酶显色与辣根过氧化物酶化学发光学对结核患者痰标本检测的应用价值。方法:采用生物素标记5′端18bp的寡核苷酸探针斑点杂交的碱性磷酸酶显色反 辣根过氧化物酶化学发光检测90例例结核患者和30例非结核患者痰标本,结果:痰标本基因组DNA直接与探针杂交,碱性磷酸酶显色反应检测阳性率为22.2%,辣根过氧化物酶化学发光检测阳性率为33.3%,痰标本经引物PL1、PL2扩增(扩增产物350bp,)与寡核苷酸探针杂交,碱性磷酸酶显色反应检测阳性率为77.8%,辣根过氧化物酶化学发光检测阳性率为83.3%,痰标本经引物b扩增(扩增产物250bp)与探针杂交,碱性磷酸酶显色和化学发光检测阳性率分别为75.6%,80.0%,检测的敏感性高于痰涂片。寡核苷酸探针与30例非结核患者痰标本DNA杂交则全为阴性。结论:寡核苷酸探针和250bpPCR扩增产物相结合,经化学发光显色是分枝杆菌检测的一种有效方法。 相似文献
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应用DNA探针直接检测结核分枝杆菌DNA 总被引:1,自引:0,他引:1
由于DNA探针杂交反应特异性高 ,国内外研究者已采用DNA探针杂交技术检测结核分枝杆菌。但该检测方法敏感性较低 ,通常采用与聚合酶链反应 (PCR)扩增相结合的方法。但这样增加了实验的费用和交叉污染的机会。我们在对DNA探针与PCR结合检测临床标本进行系统研究的基础上 ,发现临床标本简化法处理 ,即DNA探针化学发光检测 ,DNA损失较少 ,还可提高检测的敏感性 ,现将结果报道如下。材料与方法一、菌种来源受试分枝杆菌标准株来自中国药品生物制品检定所。二、标本收集结核患者痰标本 2 31份 ,血液标本 85份 ,脑脊液、胸、… 相似文献
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传染性非典型肺炎 (SARS)是一种由冠状病毒感染而引起的急性呼吸道传染病 ,尚缺乏快速、灵敏、准确的诊断方法。因此 ,建立SARS病毒的检验方法 ,是一项急需解决的研究课题。本研究对现常用的 2种检验方法进行比较。1 .标本来源 :病例组 71例均为本院确诊的SARS住院患者 ,男 33例 ,女 38例 ;对照组 1 0 9名均为本院工作人员 ,男 4 8名 ,女 6 1名。2 .方法 :ELISA法 :2组每人空腹抽血 2ml,离心 ,取血清 0 1ml,加在已包被抗原的测试板内 ,振荡 30s后 ,37℃孵育 30min ,用PBS洗板 5次 ,甩干 ,加底物显色 0 1ml混匀 ,放置避光处 1 0min… 相似文献
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目的 构建结核分支杆菌分泌蛋白Ag85A编码基因的DNA疫苗。方法 以结核分支杆菌H37Rv基因组为模板,PCR扩增Ag85A编码基因,用限制性内切酶消化后,插入真核表达载体pVAXl中,转化大肠杆菌DH5α,进行重组子筛选、鉴定。结果 以结核分支杆菌H37Rv基因组为模板,用Ag85A引物PER扩增出1041bp特异性片段,以重组子DNA为模板用Ag85A引物PCR扩增为阳性,重组子经限制性内切酶消化后可见目的片段,所测定序列与报道的Ag85A序列一致。结论 成功地构建了结核分支杆菌Ag85A基因真核表达株,该DNA疫苗的免疫效果有待进一步研究。 相似文献
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16S—23S rDNA间隔区序列PCR和RFLP分析对分枝杆?… 总被引:2,自引:0,他引:2
目的 对结构分枝杆菌复合菌群、岛、胞内分枝杆菌复合菌群以及龟分枝杆菌龟亚种及脓肿亚种等几种快速生长分枝杆菌进行鉴定。方法 应用通用引物a及结核分枝杆菌特异的引物b,对受试菌种的16S-23S rDNA间隔区序列进行PCR扩增,并对引物a扩增产物进行限制性内切酶HaeⅢ、MSPⅠ消化反应。结果 应用引物a PCR护增及RFLP分析能将除结核分枝杆菌复合菌群外的受试的其它菌群中的各种区别开;而引物b对 相似文献