人皮肤成纤维细胞的分离培养及鉴定

目的：建立人皮肤成纤维细胞的体外原代及传代培养并鉴定的技术方法.方法：取临床无菌切除的幼儿包皮,利用胶原酶分离表皮和真皮,将真皮剪成肉糜状,再用胰蛋白酶消化,接种于培养皿,加少许含10％小牛血清的DMEM-高糖培养液进行培养,次日补加培养液.原代长满后,进行传代,并对所培养的细胞进行形态学观察及组化鉴定.结果：接种次日倒置镜下可见有长梭形细胞迁出、生长,5-6d进行传代,传代后约5d长满,可长期传代.免疫组化Vimentin表达阳性.结论：该方法可快速高效获得构建组织皮肤真皮所需的成纤维细胞.     

2型糖尿病患者红细胞胞浆钙调素活性变化的研究

目的 对２型糖尿病患者红细胞胞浆中可溶性钙调素（ＣａＭ）的活性及其影响因素进行观察。方法 研究对象为７０例２型糖尿病住院患者,其中４６例单用口服降糖药（ＯＨＡ）,磺脲类治疗３２例,双胍类治疗２０例,拜诏苹治疗４例;２４例使用胰岛素（Ｉｎｓ＿、Ｉｎｓ＋ＯＨＡ治疗３周以上。红细胞胞浆可溶性ＣａＭ用纯化ＰＤＥ法测定。结果 （１）２型糖尿病患者红细胞胞冻中可溶性ＣａＭ活性明显低于正常对照组（Ｐ〈０．０５）     

孔雀绿比色法同步测定红细胞溶血液中Ca~（2＋）－ATP酶和Na~＋、K~＋－

用孔雀绿比色法可测出０．１μｇ磷，重现性好，变异系数为２．０３％，回收率为９４．４％～１０３．４％，显色稳定，操作简便。红细胞膜Ｃａ￣（２＋）－ＡＴＰ酶和Ｎａ￣＋、Ｋ￣＋－ＡＴＰ酶经低渗皂素溶血后，在Ｃａ￣（２＋）、ＥＧＴＡ或哇巴因的存在下，水解ＡＴＰ释出的无机磷，用孔雀绿法可分别测出其酶活性。     

人原发性肝癌中p16基因缺失突变研究

目的　探讨 p16基因缺失和突变在人原发性肝癌分子发病机理中所起的作用。方法　采用多重PCR和 PCR- SSCP对 31例人原发性肝癌、31例癌旁肝硬化组织以及 8例正常人白细胞中 p16基因第一 ,二外显子和部分第一 ,二内含子缺失和突变进行了研究。结果　在 31例人原发性肝癌中发现 4例 p16基因第一外显子和部分第一内含子区域缺失 ,缺失率为 13% ,第二外显子和部分第二内含子区域未见缺失 ;SSCP分析发现在肝癌和癌旁肝硬化组织中 p16基因第一内含子及其下游第二外显子 18bp区域存在三种单链构象 ,第一外显子、大部分第二外显子以及部分第二内含子未见异常的 SSCP区带 ,而在正常人白细胞中有两种单链构象。结论　在人原发性肝癌中 p16基因缺失频率较低 ,罕见突变     

人乳头瘤病毒16L1-E5表达质粒的构建及其蛋白表达

目的构建人乳头瘤病毒16L1-E5的原核表达质粒,并进行表达融合蛋白,为下一步探讨该蛋白是否能作为疫苗的研究作准备。方法以本室已构建好的阳性质粒pET32（＋）／HPV16E5为模板,PCR获得E5基因,经SalI和NotI双酶切插入已构建好的pGEX4T-1／HPV16L1,通过筛选获得正确的阳性克隆pGEX4T-1／HPV16L1-E5。pGEX4T-1／HPV16L1-E5转化入BL21感受态细胞,经IPTG诱导进行目的蛋白的表达,通过测定不同时间、不同IPTG浓度和不同温度时目的蛋白表达情况,获得蛋白表达的最佳条件,SDS-PAGE和Westernblot检测蛋白表达。结果成功构建了质粒pGEX4T-1／HPV16L1-E5,在1mmol／L IPTG、34℃、4h诱导获得最大量的目的蛋白表达。结论成功构建的pGEX4T-1／HPV16L1-E5质粒能表达出目的蛋白,为进一步研究目的蛋白功能打下了坚实的基础。     

肝细胞膜钠泵活性变化在胆红素钙结石成石过程中的作用

目的 探讨肝细胞膜钠泵（Na^ -K^ -ATPase)活性变化在胆红素钙结石成石程中的作用。方法 采用胆红素钙结石兔模型进行研究，对照组28只，胆道不全梗阻组（BO组）36只，胆道不全梗阻加感染组（BOI）组39只，各组再按术后处死时间3d、7d、14d及20d时相分组。动态测定各组各时相肝细胞膜钠泵活性、肝细胞钙及胆汁中胆汁酸含量。结果 BO组及BOI组肝细胞膜钠泵活性及胆汁中胆汁酸含量进行性下降，肝细胞钙含量呈进行性增多，与对照组相比差异有显著性意义（P＜0．01），但BOI组上述变化较BO组明显（P＜0．05）。结论 胆红素钙结石成石成过程中存在肝细胞膜钠泵活性的进行性下降。钠泵活性下降引起肝细胞钙超负荷及胆汁中胆汁酸含量下降，从而促进成石。细菌感染加重上述变化，使结石形成增多。     

人原发性肝癌中p15基因第二外显子突变研究

为探讨ｐ１５抑癌基因在人原发性肝癌分子发病机理中所起的作用，采用ＰＣＲ－ＳＳＣＰ对３５例人原发性肝癌、３５例癌旁肝硬化组织以及１０例正常人白细胞中ｐ１５基因第二外显子的突变进行了初步研究。结果显示：除１例癌旁肝硬化组织中发现迁移率异常的ＳＳＣＰ区带外，其余肝癌及癌旁组织未见异常ＳＳＣＰ区带。对该例异常ＳＳＣＰ区带ＤＮＡ进行克隆和序列分析，显示为３４５ｂｐ野生型的ｐ１５基因第二外显子序列。由此提示：人原发性肝癌中ｐ１５基因第二外显子突变发生率很低或没有突变。     

SARS相关冠状病毒M蛋白基因重组核酸疫苗的实验研究

目的：构建针对SAILS相关冠状病毒M蛋白基因的重组核酸疫苗，观察其免疫小鼠后肌体的抗体产生情况，探讨其作为抗SAILS病毒疫苗的可能性。方法：通过分子生物学的方法构建SARS相关冠状病毒M蛋白基因真核表达质粒pcDNA3．1／M。经肌注免疫健康BALB／c小鼠，在免疫后的2．4、6周取小鼠血清，用ELISA法检测其中的抗体。结果：接种含M基因的真核表达质粒pcDNA3．1／M的低剂量组和高剂量组的小鼠血清在接种2周后就可检测出SARS-CoV特异性IgG，第4周时，这种特异性IgG水平有升高趋势，第6周时，血清中的抗体含量与4周时无大的差异。高剂量组产生抗体与低剂量组产生抗体无显著差异。pcDNA3．1空载体接种的对照组未检测出特异性抗体（其OD值低于0．18）。结论：构建的真核表达质粒pcDNA3．1／M能诱导小鼠产生了针对SARS的抗体。     

不可分型流感嗜血杆菌重组Hap蛋白免疫抗小鼠急性感染的实验研究

目的:观察重组Hap蛋白免疫抗不可分型流感嗜血杆菌(NHTi)感染的免疫保护效果,初步探讨其保护机制。方法:用纯化的Hap重组蛋白与黏膜免疫佐剂霍乱肠毒素B亚单位(CT-B)联合鼻腔免疫C57BL/6小鼠。NHTi琼脂珠悬液对免疫小鼠进行气管内注射,建立小鼠NHTi急性肺部感染模型。NHTi攻击5d后,收集实验小鼠的支气管肺泡灌洗液(BALF)进行白细胞计数,并取其肺组织进行肺部荷菌数检测及肺组织的病理检测。结果:Hap重组蛋白与CT-B的联合免疫能显著降低小鼠BALF中的白细胞总数、中性粒细胞渗出(P0.05)及感染小鼠肺组织内NTHi的荷菌数,并减轻感染小鼠支气管、细支气管周围及肺泡内的炎性浸润程度,明显改善其肺组织的病变。结论:鼻腔免疫的Hap重组蛋白在动物体内能发挥良好抗NTHi感染的免疫保护作用,为NTHi新型疫苗的研发提供了理论基础和实验依据。