重组犬α干扰素在昆虫细胞中的高效表达与抗病毒活性鉴定北大核心CSCD

目的利用杆状病毒表达系统制备犬α干扰素(Canine interferon-α,CaIFN-α)。方法根据昆虫细胞密码子偏爱性优化CaIFN-α基因,构建含双拷贝CaIFN-α优化基因的载体pFastBacDual-CaIFNα-CaIFNα,转化DH10Bac感受态后获得重组基因组rBacmid-CaIFNα-CaIFNα,转染Sf9细胞获得重组杆状病毒rBac-CaIFNα-CaIFNα,接种Sf9细胞表达rCaIFN-α。采用PCR和透射电子显微镜鉴定重组杆状病毒的外源基因与病毒形态,采用间接免疫荧光染色法检测rCaIFN-α蛋白的表达,采用细胞病变抑制法测定rCaIFN-α抑制水疱性口炎病毒(VSV-GFP)在MDCK细胞的复制能力。结果重组杆状病毒rBac-CaIFNα-CaIFNα构建成功,rCaIFN-α在rBac-CaIFNα-CaIFNα感染的Sf9细胞中表达,其抗病毒活性为8.73×105 IU/ml。结论构建的杆状病毒表达系统能高效表达rCaIFN-α,该干扰素具有高效抗病毒活性,这为犬干扰素制剂的研究奠定了基础。     

小鼠HMGB1 B box基因的原核表达及其活性鉴定

目的：克隆小鼠HMGB1 B box基因,表达具有明显致炎活性的鼠HMGB1 B box蛋白,为深入研究其生物学功能以及新型抗炎制剂的研发奠定基础,也为进一步探讨其与H5N1禽流感病毒性肺炎的相关性奠定了基础。方法：从小鼠的肺脏组织中提取总RNA,经RT-PCR扩增小鼠HMGB1中的B box的cDNA,构建于载体pMD-18T并进行序列测定,随后构建于原核表达载体pET-28a（＋）中。IPTG诱导4小时后可见Mr约13000的蛋白。经Ni2＋亲和层析柱纯化获得高纯度的HMGB1 B box蛋白,然后用此蛋白刺激小鼠外周血单核细胞（PBMCs）,作用6小时后用ELISA检测PBMCs释放TNF-α、IL-6的含量。结果：经RT-PCR扩增得到了240bp的DNA片段,经序列分析与Genebank中报道的已知序列完全一致;成功构建了含有HMGB1 B box编码序列的原核表达载体;纯化表达的HMGB1 B box蛋白能显著地刺激小鼠PBMCs释放致炎因子TNF-α、IL-6,具有较好的生物活性。结论：原核表达的小鼠HMGB1 B box蛋白具有较好的生物活性,为进一步研究HMGB1 B box的作用机制以及新型抗炎制剂的研究奠定了基础。     

表达IL-33蛋白重组狂犬病病毒的构建及鉴定北大核心CSCD

目的以狂犬病病毒(RABV)弱毒株SAD为载体,构建表达IL-33蛋白的重组狂犬病病毒株SAD-IL33。方法利用反向遗传学技术,通过Pfl23Ⅱ和NheⅠ位点经酶切连接,将鼠源IL-33基因ORF区插入狂犬病病毒SAD株的伪基因区,获得全长感染性克隆,与辅助质粒共转染BHK-21细胞,拯救重组病毒SAD-IL33,采用RT-PCR、免疫荧光及Western blot鉴定SAD-IL33的生物学特性,并用其感染小鼠,每天观察小鼠体重及精神状态的变化,初步评价其安全性。结果PCR和测序证实,含IL-33基因的感染性克隆SAD-IL33构建成功;经RT-PCR、免疫荧光及Western blot鉴定,重组病毒SAD-IL33可扩增出1065 bp的预期条带,同时有RABV G蛋白和IL-33蛋白的特异性荧光,且分子质量单位为70 ku和30 ku,与预期大小一致;SAD-IL33的细胞适应性良好,在BHK-21细胞和Neuro-2a细胞上均能生长,滴度峰值分别为108.345FFU/ml和109FFU/ml,均高于亲本SAD株。将其在BHK-21细胞上连续传代10次,第3~10代的病毒滴度介于106~108 FFU/ml之间。小鼠感染SAD-IL33后,21 d内体重及精神状态无异常变化。结论成功构建表达IL-33蛋白的重组狂犬病毒SAD-IL33,细胞适应性良好且滴度高,传代稳定,对小鼠无明显影响,为进一步研制安全、高效、廉价的狂犬病预防疫苗奠定了基础。     

核酸疫苗递送与免疫增强方法研究进展

在全球免疫计划中,DNA疫苗是理想的候选者。由于它成本低并且容易大规模生产,使得低收入国家也能受益。然而,目前核酸疫苗的真正潜力还没有被发掘出来,主要由于它在体内的吸收效率低导致该疫苗的免疫原性不强。本文对近年来一些具有创新性和发展前景的提高核酸疫苗细胞转递和有效性的方法进行综述。     

反向遗传学技术及其在狂犬病病毒研究中的应用

反向遗传技术是一种新兴的分子生物学技术,已广泛应用于生命科学研究的各个领域.本文综述反向遗传学技术研究进展,并讨论该技术在狂犬病病毒(Rabies virus,RV)研究中的应用.     

狂犬病病毒荧光定量RT—PCR检测方法的建立与初步应用

目的建立狂犬病病毒快速检测法。方法根据狂犬病病毒核蛋白基因的保守序列分别设计两对引物及其相应的TaqMan探针。构建pMD-N重组质粒,建立荧光定量RT-PCR绝对定量标准品,并对反应体系进行优化,建立绝对定量的标准曲线。利用10倍稀释法检验方法的灵敏度并与普通RT-PCR法进行比较;作重复性和特异性检验后进行临床标本的检测。结果构建了绝对定量的参照质粒,标准曲线相关系数为0.998。狂犬病病毒荧光定量RT-PCR检测反应的灵敏度为10个TCID_(50);5种非狂犬病病原体检测均为阴性。结论建立的狂犬病病毒的荧光定量RT- PCR检测方法快速、特异性强、灵敏度高、稳定性好,可以应用于临床样品的检测。