呼吸道真菌感染核酸胶体金试纸条快速检测方法的建立和评价

目的 采用聚合酶链式反应（PCR）技术和胶体金技术建立一种呼吸道真菌感染核酸胶体金试纸条检测方法,并对其检测效果进行评价。 方法 根据GenBank数据库选择真菌内转录间隔区（ITS）基因片段作为靶基因,应用DNAMAN软件对真菌ITS基因片段进行分析,并分别在真菌通用引物5'端用生物素（Biotin）和异硫氰酸荧光素（FITC）进行修饰标记;建立PCR体系,进行体系的最佳条件优化;确定胶体金免疫层析试纸条标记链霉亲和素的最佳标记量和质控线及检测线最佳包被物浓度,组装核酸胶体金试纸条,对试纸条的特异度、灵敏度、重复性和稳定性进行验证。 结果 水煮法提取白假丝酵母菌、新生隐球菌和毛霉菌DNA,浓度为180 μg·L^－1以上,纯度为1.60~2.10;在pH 7.0条件下,每100 μL胶体金溶液中制备胶体金标记链霉亲和素最佳标记量为 3.3 μg,质控线包被Biotin化牛血清白蛋白（BSA-Biotin）浓度为2.00 g·L^－1,检测线包被抗FITC抗体浓度为1.00 g·L^－1。核酸试纸条的特异度与电泳结果一致,仅白假丝酵母菌、新生隐球菌和毛霉菌出现阳性结果,与金黄色葡萄球菌、肺炎链球菌、乙型溶血性链球菌、铜绿假单胞菌、肺炎克雷伯菌、鲍曼不动杆菌和大肠埃希菌等常见呼吸道感染细菌无交叉反应。灵敏度检测,白假丝酵母菌、新生隐球菌和毛霉菌的DNA浓度分别为10^－4、10^－2和10^－3 mg·L^－1时核酸试纸条仍可准确检出,而普通PCR电泳结果显示白假丝酵母菌、新生隐球菌和毛霉菌最低检测浓度分别为0.01、1.00和0.10 mg·L^－1;重复性检测,在不同实验室不同操作人员对核酸试纸条进行验证,结果一致,重复性良好;稳定性检测,核酸试纸条在第6、9和12个月进行检测,结果符合预期,稳定性良好。 结论 本研究建立的呼吸道真菌感染核酸胶体金试纸条可以检测白假丝酵母菌、新生隐球菌和毛霉菌等真菌,特异度和灵敏度均较高,操作简便且快速。     

梅花鹿鞭与马鹿鞭PCR-RFLP鉴别研究

目的 建立一种应用聚合酶链式反应-限制性片段长度多态性技术(PCR-RFLP)鉴别梅花鹿鞭与马鹿鞭的方法。方法 根据梅花鹿与马鹿的细胞色素b基因序列的差异,设计并选取DNA限制性内切酶MseI来区分梅花鹿鞭和马鹿鞭。采用改良SDS法提取样本基因组DNA,经PCR扩增后进行RFLP分析,并优化PCR-RFLP反应体系及反应条件,用优化的PCR-RFLP体系对市售鹿鞭样本进行鉴定。结果 经PCR-RFLP分析,MseI可切割梅花鹿与马鹿Cyt b片段,前者被切成2个片段,后者被切成3个片段,从而将两者进行鉴别。结论 本实验建立的PCR-RFLP方法可准确鉴别梅花鹿鞭与马鹿鞭。     

Pim-1蛋白在鼻咽癌诊断和预后价值的研究

目的：分析原癌基因 Pim-1在鼻咽癌（nasopharyneal carcinoma,NPC）细胞增殖和迁移中的作用。方法通过 RT-PCR、Western blotting、免疫荧光法检测 NPC 细胞 CNE1、CNE-GL、CNE-2Z、C666-1中 Pim-1的表达,用不同浓度的 Pim-1特异性抑制剂---六羟黄酮（quercetagetin）处理 CNE1、CNE1-GL、C666-1细胞系,检测细胞的活力、克隆形成率、迁移能力。结果高分化的 CNE1细胞中 Pim-1的表达为阴性,低分化的 CNE-2Z 细胞为弱阳性,而未分化的 C666-1细胞为强阳性。CNE1-GL 细胞和 C666-1细胞在用六羟黄酮处理后显著抑制了细胞的活力、克隆形成率、迁移能力。CNE1-GL 细胞来源于 CNE1细胞,用 EP 病毒潜在膜蛋白-1（LMP-1）过表达质粒转染后,显著促进了Pim-1的表达,过表达而 CNE1细胞未受到抑制。结论这些结果表明,Pim-1的表达是反应 NPC 的增殖和迁移的一种重要标志物,靶向与 Pim-1的药物或许可以用于治疗 Pim-1过表达的 NPC 患者。     

AFP 在早期肝癌诊断中的临床价值研究

目的 探讨血清肿瘤标记物甲胎蛋白（AFP）在早期肝癌诊断中的临床价值。方法 采用电化学发光法,检测71 例肝硬化患者、46 例早期肝癌患者、25 例中晚期肝癌患者血清甲胎蛋白含量,并分析其与肝癌的临床病理特点之间的关系。结果 肝硬化组血清logAFP 水平为（0.99±0.43）ng/ml,早期肝癌组为（1.79±0.84）ng/ml,晚期肝癌组为（2.66±1.24）ng/ml,3 组比较差异有统计学意义（P <0.05）;早期肝癌组与中晚期肝癌组logAFP 比较,差异有统计学意义（P <0.05）,中晚期肝癌组AFP 水平高于早期肝癌组。血清AFP 水平与肿瘤体积呈正相关（P <0.05）。应用受试者工作特征曲线分析并确定早期肝癌诊断的最佳临界值,曲线下面积为0.824,最佳临界值为15.315 ng/ml,灵敏性为80.4%,特异性为69%。结论 AFP 对于早期肝癌的诊断,具有重要的临床价值,在临界浓度为15.315 ng/ml 时能提高早期肝癌诊断的灵敏性。     

基于多重PCR技术检测蜡样芽胞杆菌3种毒素基因方法的建立及评价

目的 基于多重PCR技术,建立一种快速检测蜡样芽胞杆菌nhe、cytK和entFM 3种毒素基因的方法,并评价其效能。 方法 煮沸法提取蜡样芽胞杆菌DNA,以蜡样芽胞杆菌nhe、cytK和entFM特异性毒素基因作为靶基因,采用NCBI primer-BLAST 5.0软件设计特异性引物,优化反应体系。建立三重PCR检测体系,并检测其特异性、灵敏度和稳定性。 结果 煮沸法提取蜡样芽胞杆菌DNA,浓度为227 mg·L^－1,纯度为1.50~1.60。采用多重PCR体系同时检测蜡样芽胞杆菌3种毒素致病基因,于退火温度56 ℃时,蜡样芽胞杆菌基因引物nhe499的扩增片段为499 bp,基因引物cytK191的扩增片段为191 bp,基因引物entFM363的扩增片段为363 bp。PCR体系扩增蜡样芽胞杆菌3种毒素基因后条带清晰明亮,且无非特异性条带,与金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌和铜绿假单胞菌均无扩增,表明蜡样芽胞杆菌基因引物nhe499、cytK191和entFM363特异性强;3种引物在同一反应体系中互不干扰。灵敏度检测,多重PCR体系最低检测限可同时达到10^－1 mg·L^－1;稳定性检测,多重PCR体系自制备起每6个月检测稳定性一致。 结论 建立的多重PCR检测体系对于蜡样芽胞杆菌nhe499、cytK191和entFM363 3种毒素基因灵敏度高、特异性强,检测结果准确稳定,检测体系具有良好稳定性,适用于快速检出蜡样芽胞杆菌的3种不同致病毒素基因。     

核酸试纸条快速检测蜡样芽胞杆菌entFM毒素基因方法的建立

目的 基于核酸试纸条技术,建立一种快速检测蜡样芽胞杆菌entFM毒素基因的方法。 方法 煮沸法提取蜡样芽胞杆菌DNA,以蜡样芽胞杆菌entFM毒素基因作为靶基因,采用NCBI primer-BLAST 5.0软件设计特异性引物并通过克隆转化鉴定PCR产物,建立并组装核酸试纸条,评价核酸试纸条的特异性、灵敏度和稳定性。 结果 蜡样芽胞杆菌DNA浓度为300 mg?L^－1,纯度约为1.60。PCR产物阳性条带经切胶回收、克隆转化和测序比对,与GenBank数据库中已登记的entFM相似性为100%。在pH值7.0条件下,每100 μL 胶体金溶液加入3.3 μg链霉亲和素浓度标记,质控线浓度为1.8 g?L^－1,检测线浓度为1 g?L^－1时,硝酸纤维素膜上质控线与检测线均可与PCR产物反应出现清晰的红色条带。按照最适条件组装成核酸试纸条,PCR产物6 μL,样品展开液100 μL,检测10 min后可观察结果。核酸试纸条特异性与电泳结果一致,仅蜡样芽胞杆菌为阳性结果,与金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞杆菌、大肠埃希菌和沙门氏菌皆无交叉反应,为阴性结果;灵敏度检测,核酸试纸条DNA质量浓度同时降至10^－3 mg?L^－1仍可准确检测,普通PCR电泳结果显示DNA质量浓度同时降至10^－1 mg?L^－1出现目的条带,核酸试纸条比普通PCR灵敏度提高100倍;稳定性检测,核酸试纸条在第6、9和12个月进行检测稳定性一致。 结论 建立的核酸试纸条检测蜡样芽胞杆菌entFM毒素基因灵敏度高、特异性强且具有良好稳定性,适用于快速鉴别蜡样芽胞杆菌entFM毒素基因。     

FuGNE6与pGPu6/GFP/neo-GPC3-iRNA质粒不同比率对HepG2细胞转染效率的影响

目的探讨转染试剂FuGNE6与pGPu6/GFP/neo-GPC3-iRNA质粒不同比率对HepG2细胞转染效率的影响,并寻找最佳的转染比例。方法采用转染试剂FuGNE6(以6μl为例)与GPC3-iRNA质粒(μg)比率分别为6∶0.5,6∶1,6∶1.5,6∶2,6∶4,6∶6及GPC3-iRNA量固定1μg(以此为例),转染试剂与GPC3-iRNA质粒(μg)比率分别为2∶1,4∶1,6∶1,8∶1,10∶1进行转染。分别用荧光显微镜、流式细胞仪及PI染色实验观察细胞转染效率及48h细胞存活率。结果FuGNE6固定为6μl时,质粒用量从0.5-2μg转化效率逐步增高,超过2μg后转染效率反而大大降低,各比例组在48h细胞存活率都在95%以上;质粒量固定为1μg时,随转染试剂增加转化效率不断增大,超过6∶1时,随转染试剂增加,48h细胞存活率也逐渐下降。结论FuGNE6与GPC3-iRNA比例为6∶1.5时转化效率最大,且细胞存活率高。     

带蒂额瓣帽状腱膜修复累及前颅底及眶纸板的鼻腔鼻窦癌1例报告

本研究报道1例累及眶内及颅内的鼻腔鼻窦癌患者,带蒂额瓣修复眶及前颅底并取得良好效果.认为带蒂额瓣因其血供丰富、取瓣面积大,是经颅面联合进路切除颅眶鼻沟通性肿瘤手术的一种良好的修复方法.     

PCR-核酸试纸条快速鉴定皮氏罗尔斯顿菌

目的 基于PCR-核酸试纸条技术,建立快速检测制药用水中皮氏罗尔斯顿菌的方法。方法 利用煮沸法提取皮氏罗尔斯顿菌基因组DNA,以皮氏罗尔斯顿菌16S rDNA为靶基因使用NCBI primer-BLAST 5.0设计一对特异性引物,经克隆转入大肠杆菌感受态细胞DH5α,鉴定PCR产物;分别在引物的5’端标记FITC与Biotin;组装核酸试纸条,建立PCR-核酸试纸条的方法;优化反应体系中胶体金标记的链霉亲和素与抗体浓度的最佳工作量;并对试纸条进行反应原理验证及灵敏度、特异性、稳定性评价;对某生物科技有限公司制药用水检测出的7株皮氏罗尔斯顿菌进行实验并利用MEGA构建进化树,对污染溯源进行分析。结果 煮沸法提取基因组浓度较好,纯度1.8~2.0;PCR产物经克隆转化、测序比对,与GenBank已登记的皮氏罗尔斯顿菌16S rDNA相似度为100%;利用胶体金放大原理,每100 μL胶体金溶液中,加入3.5 μL链霉亲和素进行标记,硝酸纤维素膜上检测线为2.0 mg/mL抗FITC抗体,质控线为1.2 mg/mL生物素化BSA,与阳性扩增产物结合产生红色条带;按照优化条件进行试纸条组装,每100 μL样品展开液中加入8 μL PCR产物,反应5 min后观察结果;核酸试纸条特异性结果与琼脂糖凝胶电泳结果一致,仅有皮氏罗尔斯顿菌为阳性结果,不动杆菌、气单胞菌、假单胞菌、非脱羧勒克氏菌均为阴性结果;核酸试纸条灵敏度评价,将DNA浓度降至10-5 ng/μL时,试纸条检测线仍有条带,较琼脂糖凝胶电泳结果灵敏度高1000倍;核酸试纸条稳定性评价,将试纸条在3、6、9、12月进行检测,稳定性较好。结论 建立PCR-核酸试纸条技术检测制药用水中皮氏罗尔斯顿菌,具有简单快速、特异性强、灵敏度高、成本较低等优点,适用于制药企业对制药用水的日常检测。