间隔区寡核苷酸分型技术用于结核分枝杆菌多重感染的初步研究

目的 初步评价间隔区寡核苷酸分型(Spoligotyping)技术在鉴定结核分枝杆菌多重感染中的应用。方法 选取结核分枝杆菌临床分离株,5 μm孔径滤膜过滤法制备单个细菌菌悬液,平板接种37 ℃培养,选取生长良好的单个菌落培养增菌,提取基因组DNA,Spoligotyping进行基因分型鉴定,比较临床分离株与相应的单克隆分离株的分型结果。结果 共选取32株结核分枝杆菌临床分离株,获得306个单克隆分离株。Spoligotyping分型鉴定结果显示30株结核分枝杆菌临床分离株与相应的单克隆分离株的分型结果一致,2株临床分离株的单克隆分离株呈现了多种基因型,多重感染率为6.25%。结论 Spoligotyping可用于快速,有效地区分结核分枝杆菌多重感染。     

结核分枝杆菌抗原Rv2654c、Rv1985c和Rv3868的克隆表达及血清诊断学初步评价

目的 评价结核分枝杆菌蛋白抗原Rv2654c、Rv1985c和Rv3868的血清诊断价值和潜在应用前景。方法 以结核分枝杆菌H37Rv标准株全基因组DNA为模板扩增得到Rv2654c、Rv1985c和Rv3868基因的完整序列, 并与表达载体pET-32a构建重组质粒。原核表达Rv2654c、Rv1985c和Rv3868蛋白, 利用亲和层析的方法进行纯化。采用棋盘滴定的方法, 确定各抗原的酶联免疫吸附试验(ELISA)最佳反应条件, 并应用190份血清进行血清IgG抗体检测, 结合受试者工作特征曲线(ROC)对其诊断效能进行分析和评价。通过ROC计算各抗原组合的诊断效能, 确定最佳组合方案。结果 成功构建了重组蛋白, 对重组后的片段进行测序, 经BLAST比对与目的基因完全一致, 且能够稳定表达。对经纯化后的3种蛋白进行ELISA检测, 经统计学分析, Rv2654c、Rv1985c和Rv3868抗原的诊断效能分别达到73.16%、56.84%和71.05%。结合ROC得到最佳的抗原组合方案为Rv2654c+Rv3868, 其敏感性、特异性和诊断效能分别达到78.95%、72.63%和75.79%。结论 结核分枝杆菌重组抗原Rv2654c、Rv1985c和Rv3868具有作为结核病诊断抗原的潜力, 可以作为结核病免疫学快速诊断的候选蛋白。抗原组合Rv2654c+Rv3868具有较高的诊断效能, 有较好的潜在应用价值。