结核分枝杆菌CFP-10／ESAT-6融合蛋白模拟抗原表位的筛选

目的探讨噬菌体展示随机肽库技术在结核分枝杆菌培养滤过蛋白10（CFP-10）／早期分泌抗原靶点6（ESAT-6）融合蛋白（CE融合蛋白）模拟抗原表位筛选中的应用。方法以抗CE融合蛋白多克隆抗体为靶分子，对随机噬菌体7肽库进行筛选，经3轮生物淘选后，随机选取18个单噬菌体进行测序分析。采用双抗体夹心和竞争ELISA方法对测序后噬菌体进行阳性克隆及其活性鉴定。采用间接ELISA方法，选取阳性单噬菌体与CE融合蛋白分别对20份活动性肺结核患者和10份有卡介苗接种史健康人的血清标本抗体进行检测。结果经过3轮生物淘选，能与靶分子特异性结合的噬菌体得到了明显富集。18个单噬菌体测序共获得9种序列，其中单噬菌体5、6、18的氨基酸序列均包含Trp-Asp-Ala-Thr（WDAT）保守序列，该序列与ESAT-6第58-61位氨基酸的序列一致。9种序列中各取1个单噬菌体经双抗体夹心和竞争ELISA检测，有7个单噬菌体（1、5、6、10、13、14、18，S／N值依次为9.2、9.7、9.4、8.9、9.6、9.9、9.0）确定为具有免疫活性的阳性克隆。选取含有WDAT保守序列的阳性单噬菌体5与CE融合蛋白分别对2种血清标本抗体进行间接ELISA检测结果显示，单噬菌体5对2种血清标本抗体检测的吸光度值均高于CE融合蛋白（分别为0．931±0．298 vs 0．317±0．157、0．496±0．073 vs 0．118±0．026，均P〈0．05）；单噬菌体5对活动性肺结核患者血清标本抗体的检出率（95％，19／20）明显高于CE融合蛋白（60％，12／20），而对有卡介苗接种史健康人血清标本抗体的检出率（9／10）低于CE融合蛋白（10／10）。结论利用噬菌体展示随机肽库技术成功筛选出7个CE融合蛋白的模拟抗原表位，并获得了定位于ESAT-6第58-61位氨基酸序列的CE融合蛋白的1个线性B细胞抗原表位，提高了ELISA检测的敏感性，为进一步研究CE融合蛋白的?     

三种结核分枝杆菌分泌蛋白的抗体制备及其在抗原检测中的应用

目的制备结核分枝杆菌CFP10-ESAT-6、MPT64和MPT63-MPT70重组蛋白抗体，探讨其在检测结核抗原中的应用价值。方法应用重组蛋白CFP10-ESAT-6、MPT64和MPT63-MPT70免疫血清，制备包被抗体和标记抗体，建立检测3种蛋白的双抗体夹心法，并将其用于17种分枝杆菌培养上清液和341份临床血清标本的检测。结果CFP10-ESAT-6的最低检出浓度为25ng／mL，MPT64和MPT63-MPT70均为50ng／mL。CFP10-ESAT-6检测17种分枝杆菌培养上清液，只有结核分枝杆菌为阳性；而MPT64和MPT63-MPT70检测除结核分枝杆菌阳性外，还各有5种非结核分枝杆菌培养上清液为阳性结果。CFP10-ESAT6、MPT64和MPT63-MPT70检测165例临床诊断的肺结核患者血清标本阳性率分别为33．9％、41．2％和47．9％；检测112例非结核患者血清标本的假阳性率分别为1．8％、7．1％和10．7％；检测64例健康对照的假阳性率分别为0、3．1％和7．8％。结论CFP10-ESAT-6、MPT64和MPT63-MPT70重组蛋白制备的抗体检测血清标本结核抗原的阳性率均不高，但特异性较好。     

IL-15参与调控肌肉与脂肪组织代谢的新进展

骨骼肌分泌的白细胞介素15(IL-15)能调控多种细胞的增殖与分化,并以内分泌和旁分泌的方式调节肌肉和脂肪组织代谢,从而维持整个机体的稳态。该领域的研究,有助于从分子水平上揭示畜禽生产中肉品质的调控途径,并提出其在治疗人类疾病(如肥胖、糖尿病、恶病质、肌肉萎缩等)方面的潜在意义。     

禽流感病毒NP基因的酵母双杂交饵载体表达及自激活检测

目的构建H5N1亚型禽流感病毒NP基因的酵母双杂交诱饵载体,验证其在酵母中的表达并检测其自激活作用。方法以PCR法从pGEMT/H5NP扩增NP基因编码区序列,将其定向克隆到PGBKT7载体,经测序鉴定后,PEG/Li-Ac法转化酵母菌株AH109,用表型筛选法及颜色筛选法检测其自激活作用同时Westernblot验证诱饵蛋白的表达。结果获得NP编码区基因,并成功构建酵母双杂交系统中的诱饵载体pGBKT7-NP,对宿主细胞酵母菌株AH109无毒性和自激活作用,并能在酵母细胞中稳定表达。结论诱饵载体pGBKT7-NP可用于GAL4酵母双杂交系统钓取与禽流感病毒核蛋白相互作用的蛋白。     

结核分枝杆菌分泌蛋白MPT53基因的克隆、表达和纯化

目的构建结核杆菌分泌蛋白MPT53原核表达载体并进行表达和纯化。方法以结核分枝杆菌标准株H37Rv基因组DNA为模板扩增MPT53基因，产物经纯化回收后与载体pMD-T连接转化，酶切鉴定，克隆到pET32a原核表达载体，测序鉴定插入序列完全正确者转化大肠埃希菌BL21，诱导表达MPT53融合蛋白，亲和层析纯化后，进行SDS-PAGE电泳鉴定。结果成功构建PET32a-MPT53重组质粒，转化BL21后经IPGT诱导成功表达分子质量单位为36ku的MPT53蛋白，与理论值相符。结论成功表达结核分枝杆菌MPT53蛋白，为其应用打下了基础。     

结核分枝杆菌分泌蛋白MPT64的克隆表达和纯化

目的构建结核分枝杆菌分泌蛋白MPT64原核表达载体并进行表达和纯化。方法以结核分枝杆菌标准株H37Rv基因组DNA为模板扩增出MPT64基因,产物经纯化回收后与载体pMD-T连接转化,酶切鉴定,克隆到pET21a原核表达载体,测序鉴定插入序列完全正确者转化大肠杆菌BL21,诱导表达MPT64融合蛋白,利用亲和层析纯化表达产物,SDS-PAGE电泳进行鉴定。结果成功构建MPT64表达载体,SDS-PAGE电泳鉴定成功表达MPT64蛋白。并以此蛋白进行结核抗体的检测,其特异性和敏感性分别为96%和43%。结论成功表达结核分枝杆菌MPT64蛋白,并进行特异性和敏感性的检测,证明重组的MPT64蛋白有希望成为结核病血清学诊断的组合抗原的候选者之一。