以报告基因荧光素酶研究HPRE功能元件与IFN-α应答的关系

目的:以荧光素酶(luciferase,LUC)基因为报告基因,探讨HBV转录后调节序列(HPRE)的功能元件(α、β1和β2)对IFNα作用的影响。方法:用PCR法从载体pGEMluc中扩增LUC基因,并克隆入真核表达载体pcDNA3.0中。以含乙肝病毒(HBV)基因组的质粒A01为模板,扩增HPRE(完整的HPRE)、HPREαβ1及HPREβ1β2片段,并分别插入LUC基因的下游。利用脂质体介导的转染法,将重组质粒分别导入人肝癌细胞株HepG2中,用LUC检测系统检测IFNα作用前后LUC表达活性的变化。结果:经测序证实,重组质粒pcDNA3.0luc、pcDNA3.0lucHPRE、pcDNA3.0lucHPREαβ1及pcDNA3.0lucHPREβ1β2构建成功。检测结果显示,IFNα作用前,HPRE、HPREαβ1和HPREβ1β2均能提高LUC的活性,IFNα作用后,HPRE和HPREβ1β2能明显降低LUC的活性,而HPREαβ1对其表达则没有显著影响。结论:HPRE的功能元件β2与IFNα作用的关系最为密切,而功能元件α和β1在IFNα应答中作用甚小,提示IFNα诱导产生的HPRE抑制性结合蛋白很可能是与β2结合的,为进一步研究IFNα在治疗HBV感染和慢性肝炎中的作用机制,以及HPRE抑制性结合蛋白的作用提供了一定的实验依据。     

应用纯化抗原对流免疫电泳技术诊断牛肝片吸虫病的研究

<正> 肝片吸虫病是一种人畜共患的寄生虫病,在我国广大地区牛、羊群中广为流行,严重危害着反刍动物的健康和畜牧业的发展。人也有患肝片吸虫病的报告。长期以来,本病的诊断主要靠粪检虫卵进行,但此法费时,且检出率低,又因耕牛在感染本病后78天左右才开始排卵,所以无法据此仵出诊断和早期治     

HCV NS5A基因在hepG2细胞中的表达以及对PI3K的影响

目的：探讨HCV—NS5A对PI3K表达的影响。方法：应用PCR技术从含有HCV全长开放阅读框的质粒中获得NS5A全长基因片段，利用基因重组技术将其克隆至真核表达载体pcDNA3．0（-）中。通过酶切、PCR及测序鉴定，NS5A基因已正确插入到pcDNA3．0（-）中，再利用脂质体转染HepG2细胞。结果：经RT—PCR及Western blot检测，HCV的NS5A基因在HepG2细胞中获得表达，而且在表达重组NS5A的转染HepG2细胞中，检测到PI3K蛋白的表达。结论：NS5A可在体外激活PI3K及其信号通路。     

以HBc颗粒为呈现载体的猪囊虫疫苗的构建及其免疫学研究

目的构建以HBc为载体的带有三个猪囊虫抗原表位(n1,n2,n3)的重组融合表达质粒pET-Δc-3n,表达出融合蛋白并纯化,通过免疫小鼠研究其体液免疫效果。方法用PCR法将三个猪囊虫表位分别插入HBc序列的第78-79位之间以及149位之后,再将该序列克隆入pET28a载体中,构建重组表达质粒,用大肠杆菌BL21作宿主菌表达出融合蛋白,并命名为PCCE,纯化后免疫小鼠,检测小鼠的体液免疫应答。用绦虫卵攻击免疫小鼠,并观察疫苗的保护作用。结果测序结果表明重组质粒构建成功,SDSPAGE显示融合蛋白表达正确,并有多聚体形成现象,ELISA检测到高滴度抗体。小鼠体内绦虫卵攻击试验表明疫苗PCCE的相对保护率为89%。结论以HBc为呈现载体的猪囊虫疫苗被成功表达和纯化,该疫苗能诱导较强的体液免疫反应,免疫小鼠对绦虫卵攻击具有较好的免疫保护作用。提示该疫苗PCCE可能具有预防囊虫病的潜在价值。     

传染性法氏囊病的防治

目的 研究以传染性法氏囊病病毒制成多价弱毒疫苗进行IBD的免疫预防效果。方法 分别从江苏、浙江等8省(市)采集IBD病鸡法氏囊病料,分离到32个野毒株,经SDS-PAGE鉴定,其中17株病毒为IBDV。应用交叉中和试验,将分离的IBDV分为5个亚型。用IBDVI型变异株高免血清作中和试验,其中5株有较高的中和效价,初步定为IBDVI型变异株。将其在CEF上连续传代致弱,与标准I型弱毒株联合制成多价弱毒疫苗。结果 试验表明它具有良好的免疫效果,免疫组攻毒100％保护,对照组攻毒死亡率为92％。以IBD病变典型的法氏囊组织制成的IBD油乳剂灭活疫苗具有满意的免疫效果。结论 将之免疫健康鸡和IBD康复鸡,制备高免血清和卵黄抗体,血清抗体的AGP效价均达1:32,最高达1:128,治疗IBD病鸡的有效率达90％～98％;卵黄抗体的AGP效价达1:64,应用于IBD病鸡治疗,治愈率达90％～95％。制备的二联卵黄抗体用于治疗IBD和ND混合感染病鸡,治愈率达71％。     

不同传染性法氏囊病病毒分离株变异的研究

目的 了解不同源IBDV和不同血清亚型IBDV病毒株的变异情况。方法 用琼脂糖凝胶电泳。SDS-PAGE和序列分析等分离生物学方法分析病毒RNA、结构蛋白的变异情况。结果 (1)三种不同源IBDV均由双节段RNA组成,大小基因片段的电泳迁移率在各病毒株间无差异;(2)SDS-PAGE分析表明各IBDV的结构蛋白带谱相同,但各蛋白带的百分含量有差异;(3)序列分析表明JS3、JS4与标准对照病毒株S1 IBDV VP2基因片段的核酸的同源性均为97％,JS_3与JS_4的同源性为99％。推导编码蛋白氨基酸序列,JS_3与S_1的同源性为97％,JS4与s1的同源性为96％,JS3与JS4的同源性为98％。结论 我国流行的IBDV病毒株与标准病毒株相比不仅在免疫学反应上有差异,而且在病毒核酸序列上有变异,这种变异是造成疫苗免疫失败或免疫逃避的分子基础。     

人源和猪源血清中囊虫循环抗原的免疫与理化性质比较

囊虫病是一种人畜共患病,在我国部分地区流行严重[1-2],也是我国"十一五"规划纲要中需重点控制的寄生虫病之一.本课题组已研制并生产了囊虫病循环抗原(CA)酶联免疫检测试剂盒,获得了国家卫生部颁发的新药证书和生产批号,首次为我国囊虫病患者的诊断和流行病学调查提供了标准化的试剂[3].     

人巨细胞病毒重组抗原及单克隆抗体在ELISA中的应用

用重组人巨细胞病毒（rhCMV)gp52蛋白作抗原及相应的单克隆抗体酶标记物建立捕获ELISA，检测人血清中的HCMV特异性IgM抗体。其工作浓度均由方阵滴定法确定。并进行精密度、特异性和干扰实验。用该法检测体检献血员病毒性肝炎患者及疑似CMV感染的肝炎综合症患者血清共计939份。结果gp52蛋白抗原最佳浓度为1μg/ml,酶标单抗的工作浓度为1：1600，批内平均变异系数CV3．7％，批间CV7．9％。634例献血员IgM抗体阳性17例（2．7％）；288例病毒性肝炎患者，阳性10例（3．5％）；17例肝炎综合症患者，阳性11例（64．7％）。均经免疫印迹法证实。该组合特异性强，灵敏度高，不受类风湿因子的影响，结果可靠，优于全病毒抗原构成的检测试剂。适用于临床诊断和流行病学调查。     

囊虫病循环抗原特性及检测方法的研究

囊虫病在我国流行范围很广,危害严重。尤其脑囊虫病,可使患者丧失劳动能力,致残甚至死亡。本病的早期诊断、类症鉴别和近期疗效考核是当前临床上极需解决的难题。传统的抗体检测在敏感性和特异性上都存在某些不足。患者愈后,其血清抗体可持续5年以上,不能用于疗效考核。国内外某些学者希望通过循环抗原(CA)的检测作为突破,解决这一难题,但因阳     

丙肝病毒非结构4区和5区抗原的克隆表达及纯化鉴定

通过分析丙肝病毒（ＨＣＶ）的非结构４区（ＮＳ４）和５区（ＮＳ５）蛋白的氨基酸序列，推测确定抗原决定簇位点。用ＲＴ－ＰＣＲ技术从中国丙肝病人血甭中扩增克隆含抗原决定簇基因的ＮＳ４及ＮＳ５基因，将该丙段基因分别克隆至质粒表达载体ｐＥＴ２８ａ（＋）内，转化大肠杆菌ＢＬ２１（ＤＥ３），成功了高儿表达ＮＳ４和ＮＳ５蛋白的工程菌，ＩＰＴＧ诱导后两蛋白在工程菌内的表达量分别约占菌体蛋白的３３％和２８％。经Ｓｅｐ