心脏高表达基因hhole通过ERK结合位点抑制心肌肥厚信号分子ANF的转录活性

目的探讨心脏高表达基因hhole调控心肌肥厚信号分子ANF的转录活性的分子机制。方法利用生物信息学在线软件分析hhole蛋白的分子结构。利用酶切法和环状诱变技术突变得到hhole基因的突变体重组质粒。将突变体和野生型的重组质粒分别转染HEK293细胞系,测定荧光素酶报告基因ANF的转录活性。结果生物信息学分析发现hhole蛋白含有ERK结合位点和多聚脯氨酸序列。利用酶切法构建了4个截短突变体重组质粒,环状质粒定点诱变的方法构建了3个定点突变的突变体。荧光报告系统分析发现pCMV-tag2B-TD与pCMV-tag2B-hhole全长均能强烈地抑制ANF的转录活性。结论 hhole蛋白主要通过其ERK结合位点抑制心肌肥厚信号分子ANF的转录活性。     

靶向人类心脏发育候选基因hole的siRNA真核表达载体的构建和鉴定

目的利用siRNA表达载体构建靶向人类心脏发育候选基因hole的pSUPER RNAi载体系(pSUPER-hole)及筛选稳定产毒的细胞克隆。方法化学合成一对编码短发夹RNA序列的、靶向人类心脏发育候选基因hole的寡核苷酸链60个碱基,退火,克隆到经BglⅡ、XhoⅠ双酶切的pSUPER质粒上,构建重组RNAi质粒(pSU-PER-hole)。通过双酶切鉴定及测序分析验证构建效果。将正确构建的质粒转染大鼠心肌细胞H9c2,经过puro抗生素的筛选,建立稳定产生逆转录病毒的细胞模型,采用RT-PCR检测其抑制效果。结果 pSUPER-hole载体经双酶切鉴定及测序分析,结果表明60个碱基成功插入到预计位点,并且序列完全一致。重组载体转染包装细胞,筛选的细胞克隆均可表达绿色荧光蛋白,表明包装成功。RT-PCR检测表明pSUPER-hole能成功抑制hole基因的表达。结论靶向人类心脏发育候选基因hole的siRNA真核表达载体构建成功。     

桑叶提取物对APAP诱导小鼠急性肝损伤的保护作用

目的：探究桑叶提取物对对乙酰氨基酚(APAP)诱导小鼠急性肝损伤的保护作用。方法：选取30只健康雄性昆明小鼠(KM),分为对照组、APAP模型组、桑叶提取物组，每组10只。桑叶提取物组预防性连续给药7 d,末次给药2 h后桑叶提取物组和APAP模型组腹腔注射300 mg/kg APAP,建立急性肝损伤模型。24 h后取材，观察肝脏损伤情况，生化法检测血清中谷丙转氨酶(ALT)、谷草转氨酶(AST)水平，HE染色观察肝脏组织病理损伤程度。结果：与对照组相比，APAP模型组的肝组织肉眼可见部分点状瘀血坏死，血清中AST、ALT明显升高，HE染色镜检见肝脏组织有凝固样坏死；而桑叶提取物组的肝脏损伤较APAP模型组明显减轻。结论：桑叶提取物对APAP诱导的小鼠急性肝损伤具有保护作用。     

人类心脏发育候选基因KLHL31RNAi逆转录病毒载体系统的构建与鉴定

目的:利用siRNA表达载体构建抑制人类心脏发育候选基因KLHL31表达的pSUPER RNAi载体( pSUPER-KLHL31).方法:化学合成一对编码短发夹RNA序列的、靶向心脏发育候选基因KLHL31的寡核苷酸链60个碱基,退火,克隆到经BglⅡ、Xho Ⅰ双酶切的pSUPER质粒上,构建重组RNAi质粒(pS...     

小鼠睾丸基因PDZD9的克隆及亚细胞定位分析

目的 克隆小鼠睾丸基因PDZD9并构建pEGFP-C1-PDZD9重组栽体进行亚细胞定位分析. 方法 提取小鼠睾丸RNA,利用逆转录—聚合酶链反应(RT-PCR)技术从小鼠睾丸cDNA中分离PDZD9基因.将PDZD9基因定向克隆至带有绿色荧光报告基因的真核表达载体pEGFP-C1.利用阳离子聚合物方法转染COS7细胞,荧光显微镜下观察其亚细胞定位. 结果 小鼠睾丸基因PDZD9克隆成功,成功构建真核表达载体pEGFP-C1-PDZD9,亚细胞分析表明该蛋白定位于细胞核和细胞质中,主要分布在细胞核中. 结论 成功克隆了小鼠睾丸基因PDZD9,并初步分析了其在细胞中的定位情况,为下一步对PDZD9的功能研究奠定了基础.