人核因子κBp65核定位信号缺失突变对A549细胞恶性表型的影响

目的鉴定人核因子κB(NF-κB)p65核定位信号(NLS)缺失突变质粒即pc DNA3.1(+)-NF-κBp65ΔNLS(简称NF-κBp65ΔNLS)的表达功能,以及其对低表达NF-κBp65的A549细胞株即A549/NF-κBp65 shRNA细胞增殖、迁移和粘附能力的影响。方法培养人A549/NF-κBp65 shRNA细胞株,分为对照组、转染pc DNA3.1(+)组、转染NF-κBp65ΔNLS组。应用间接免疫荧光、实时荧光定量-PCR和Western blot技术检测NF-κBp65的细胞内定位及mRNA、蛋白表达水平的变化;应用MTT、Transwell和细胞粘附实验分析转染NF-κBp65ΔNLS质粒对A549/NF-κBp65 shRNA细胞增殖、迁移、粘附能力的影响。结果成功构建人NF-κBp65ΔNLS真核表达质粒。转染NF-κBp65ΔNLS质粒的A549/NF-κBp65 shRNA细胞与对照组及转染pc DNA3.1(+)组比较,NF-κBp65 mRNA表达水平明显上调(10.63±0.84比1.04±0.21和1.23±0.22,P0.01),NF-κBp65蛋白表达水平明显升高(1.07±0.06比0.53±0.02和0.59±0.04,P0.01),且NF-κBp65蛋白主要位于细胞浆内,在肿瘤坏死因子α刺激后NF-κBp65蛋白并未明显进入细胞核。与对照组及转染pc DNA3.1(+)组比较,转染NF-κBp65ΔNLS质粒的A549/NF-κBp65 shRNA细胞的增殖、迁移和粘附能力均有不同程度增强。结论通过基因突变技术构建无NLS的NF-κBp65真核表达质粒,可明显增强A549/NF-κBp65shRNA细胞株内NF-κBp65 mRNA和蛋白的表达水平,并使NF-κBp65蛋白定位于细胞浆内;同时,细胞浆内过表达NF-κBp65ΔNLS蛋白可明显增强A549/NF-κBp65 shRNA细胞的增殖、迁移和粘附能力,提示滞留于细胞浆内的NF-κBp65仍可通过影响NF-κB信号通路相关蛋白参与调节肺癌细胞的生物学行为。     

小干扰RNA干扰核因子κB信号通路对内毒素刺激巨噬细胞释放肿瘤坏死因子α的影响

目的 探讨小于扰RNA(siRNA)抑制核因子κB(NF-κB)信号通路对细菌脂多糖(LPS)刺激的巨噬细胞释放肿瘤坏死因子α(TNF-α)的影响.方法 人单核细胞白血病THP-1细胞经氟波酯诱导为巨噬细胞后分2组,分别感染应用分子克隆技术构建的针对NF-κB P65的siRNA逆转录病毒质粒(siRNA病毒组)及乱序(Scramble)对照序列逆转录病毒质粒(Scramble病毒组).用终浓度50μg/ml的LPS持续刺激2组巨噬细胞,分别应用RT-PCR技术检测LPS刺激不同时间巨噬细胞NF-κB P65 mRNA和TNF-α mRNA表达水平,蛋白质印迹法检测NF-κB P65蛋白表达水平,酶联免疫吸附试验检测巨噬细胞培养上清液TNF-α含量.结果 LPS刺激12和24 h,siRNA病毒组巨噬细胞NF-κB P65 mRNA表达水平(0.97±0.02,0.89±0.01)明显低于Scramble病毒组(1.01±0.03,0.97±0.01,均P＜0.05);LPS刺激24和72 h,siRNA病毒组NF-κB P65蛋白表达水平(0.95±0.04,0.94±0.01)明显低于Scramble病毒组(1.07±0.06,1.03±0.05,均P＜0.05).LPS刺激4、8、12和24 h的各时点,siRNA病毒组TNF-α mRNA表达水平均明显低于Scramble病毒组(0.92±0.02比0.98 ±-0.01,0.86±0.02比1.00±0.01,0.79±0.03比1.01±0.01,0.78±0.03比1.02±0.01,均P＜0.05).LPS刺激2、4、8、24、36、48、54和72 h的各时点,siRNA病毒组巨噬细胞培养上清液TNF-α含量均明显低于Sramble病毒组(均P＜0.01).结论 针对NF-κB P65的siRNA可抑制NF-κB信号通路的功能活性,进而抑制内毒素刺激引起的巨噬细胞活化和TNF-α释放,提示RNA干扰技术在急性肺损伤早期过度炎症反应的防治中具有潜在应用价值.     

靶向小鼠核因子κB P65的小干扰RNA逆转录病毒载体的构建与鉴定

目的构建靶向小鼠核因子κB（NF-κB）P65进行RNA干扰（RNAi）的逆转录病毒载体,鉴定其生物学效应。方法采用分子克隆技术构建靶向小鼠NF-κB P65 siRNA的逆转录病毒载体,转染293E细胞,包装成逆转录病毒,以不同滴度感染小鼠单核巨噬细胞J774A.1,用相同浓度的脂多糖（LPS）刺激,在不同时间点用RT-PCR和Western blot从mRNA和蛋白水平上检测细胞NF-κBP65表达,并用RT-PCR和ELISA方法检测肿瘤坏死因子α（TNF-α）表达。结果成功构建靶向小鼠NF-κB P65基因的小干扰RNA逆转录病毒表达载体。经LPS刺激后,siRNA病毒组J774A.1细胞中NF-κB P65 mRNA的表达明显受到抑制,2 h即明显低于Scramble病毒组（0.91±0.03比1.02±0.02,P〈0.01）,此后持续降低;在LPS刺激后的24、36、48和72 h,siRNA病毒组NF-κB P65蛋白表达均明显低于Scramble病毒组（0.97±0.02比1.01±0.01,0.94±0.01比1.02±0.01,0.94±0.02比1.02±0.01,0.93±0.01比1.00±0.02,P〈0.05）。LPS刺激后2、6、12和24 h,siRNA病毒组TNF-α的mRNA表达水平均明显低于Scramble病毒组（P〈0.01）,而相同时间点siRNA病毒组细胞上清TNF-α的含量亦明显低于Scramble病毒组（P〈0.01）。结论将小干扰RNA片段连接到空白质粒中构建逆转录病毒表达载体的方法是可行的。采用RNA干扰技术抑制NF-κB的表达后,可以减少其下游炎症因子的释放,提示RNA干扰技术在炎性损伤性疾病如急性肺损伤的防治中具有潜在应用价值。     

革兰阴性杆菌血流感染60例患者的临床资料分析

目的探讨革兰阴性(G–)杆菌血流感染的临床及细菌学特点,为治疗G–杆菌血流感染提供指导。方法回顾性分析2015年1月至2017年12月北京安贞医院呼吸与危重症医学科收治的60例重症肺炎合并血流感染的患者临床资料,评价住院病死率及其危险因素。结果共纳入60例患者,其中男34例,女26例,平均年龄(73.4±11.2)岁。60例重症肺炎合并血流感染的患者中,感染肺炎克雷伯菌32例,鲍曼不动杆菌20例,大肠埃希菌8例。药敏结果显示:肺炎克雷伯菌对阿米卡星耐药率低(6.3%),未发现对替加环素耐药;大肠埃希菌对阿米卡星、亚胺培南、头孢他啶和美罗培南敏感性较好,对其他药物耐药;鲍曼不动杆菌的耐药率较高,其中对头孢哌酮/舒巴坦为28.6%(中介12.5%),对替加环素为14.3%(中介28.5%)。肺炎克雷伯菌和鲍曼不动杆菌两组患者感染指标及预后指标对比显示:鲍曼不动杆菌血流感染患者血清C反应蛋白、降钙素原及序贯器官功能障碍评分(SOFA)较高;肺炎克雷伯菌血流感染患者中性粒细胞和血乳酸水平较高;两组患者白细胞、血小板水平及死亡率差异无统计学意义。SOFA评分和血乳酸水平与患者预后具有显著相关性。结论 G–杆菌中肺炎克雷伯菌和鲍曼不动杆菌血流感染出现泛耐药菌株比例高,患者病死率高。     

大动脉炎肺动脉受累患者的临床特征研究

目的探讨大动脉炎肺动脉受累患者的临床特点,以提高对该病的认识。方法回顾性分析首都医科大学附属北京安贞医院2007年1月至2017年8月间收治大动脉炎肺动脉受累患者的临床资料。结果 10年间安贞医院共收治大动脉炎患者233例,肺动脉受累患者17例,占同期所有大动脉炎患者的7.3%。其中,男3例,女14例,男女比例1∶4.67。确诊年龄16~59岁,平均(40±13)岁。临床表现最常见的症状为活动后气促(15例,88.2%),最主要的体征为双上肢收缩压差10 mm Hg(9例,52.9%),其次为脉搏减弱或无脉(6例,35.3%)以及受累血管局部可闻及血管杂音(6例,35.3%)。超声心动图检查发现13例患者有肺动脉高压,肺动脉造影显示多累及肺叶、段动脉,单侧多于双侧,右侧多于左侧。13例患者接受糖皮质激素及免疫抑制剂治疗,11例抗凝或抗血小板治疗;5例行降肺动脉压的靶向治疗。结论大动脉炎肺动脉受累患者的临床表现无特异性,误诊率高。应提高大动脉炎合并肺动脉受累的早期诊断意识,及早干预,改善患者预后。     

云南汉族人群VKORC1 1173C/T基因多态性与华法林抗凝治疗维持剂量的相关性研究

目的研究云南汉族人群维生素K环氧化物还原酶复合体亚单位1基因VKORC1 1173C/T多态性分布及与其他群体间的差异,并探讨其与华法林抗凝维持剂量的分子遗传关系.方法采集300名心脏机械瓣膜置换术后服用华法林抗凝已达稳定剂量、凝血酶原时间国际标准化比值在目的范围(1.5～3.0)病人的外周血,采用聚合酶链式反应-限制性片段长度多态性(PCR-RFLP)分析技术,检测VKORC1 1173C/T基因位点的基因型和等位基因频率,探讨华法林抗凝维持剂量与该基因多态性的关系.结果在所有的样本中,VKORC1 1173C/T基因共检出C(10%)和T(90%)2种等位基因,纯合子TT(80%)和杂合子CT(20%)两种基因型,云南汉族人群中VKORC1 1173C/T基因多态性分布在性别和年龄上无差异;CT基因型病人所需华法林维持剂量最高(3.62±1.35)mg/d,其次是TT基因型病人(3.12±1.17)mg/d.结论与其他群体相比,云南汉族人群VKORC11173C/T基因位点具有自己的遗传多态性,其基因型在华法林抗凝治疗中具有非常重要的意义.     

肾移植术后低血压引起少尿患者应用多巴胺的护理体会

肾移植术后患者易出现低血压致少尿的症状,进而影响患者的预后以及术后恢复,本文对13例肾移植术后低血压患者应用多巴胺持续静脉治疗效果进行总结,并了解到使用该治疗方法可提升并维持患者的血压与尿量,减轻组织血肿,促进移植肾功能的早期恢复,值得推广。     

呼吸与危重症医学科鲍曼不动杆菌感染情况及耐药性分析

目的分析北京安贞医院呼吸与危重症医学科鲍曼不动杆菌感染情况及耐药性变迁。方法回顾性分析2005年1月-2016年12月北京安贞医院呼吸与危重症医学科住院患者感染的鲍曼不动杆菌感染以及耐药性等情况,分三个阶段(Ⅰ阶段为2005-2008年,Ⅱ阶段为2009-2012年,Ⅲ阶段为2013-2016年)进行分析。结果 2005-2016年共分离出鲍曼不动杆菌1382株,其中Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ阶段分别为206、496、680株。鲍曼不动杆菌在标本中的分布以呼吸道分泌物为主,达98. 22%,其次血液为1. 37%,尿液为1. 30%。在药敏结果中,鲍曼不动杆菌对替加环素耐药率最低为1. 35%。在Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ阶段,鲍曼不动杆菌对头孢哌酮/舒巴坦的耐药率较低,分别为26. 00%、15. 08%、25. 73%;对亚胺培南的耐药率分别为27. 18%、84. 01%、83. 04%,对美罗培南耐药率分别为51. 52%、83. 49%、77. 62%。在Ⅲ阶段,鲍曼不动杆菌对左氧氟沙星的耐药率为60. 86%,对哌拉西林/他唑巴坦、环丙沙星、头孢他啶及头孢曲松的耐药率均在80%以上。结论鲍曼不动杆菌对多种抗菌药物呈严重耐药,治疗困难。临床需通过加强细菌的耐药性监测,根据药敏试验结果合理选择抗菌药物,并加强院感管理等措施,有效控制耐药菌株的流行及医院感染。     

NF-κBp65/IκBα在非小细胞肺癌组织中的表达

目的从蛋白和RNA水平研究NF-κBp65、IκBα在非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC)组织中的表达特点,探讨其在肺癌发生中的作用。方法免疫组化、Western blot方法检测NSCLC和癌旁肺组织中NF-κBp65和IκBα蛋白的表达,实时定量-PCR方法检测NF-κBp65和IκBα基因表达。结果共检测NSCLC组织62例(腺癌33例,鳞癌29例),癌旁肺组织27例。免疫组化显示NSCLC组织中NF-κBp65阳性表达率分别为58.6%和60.9%,显著高于癌旁肺组织(P均0.0001),而IκBα阳性表达率分别为12.3%和1.4%,显著低于癌旁肺组织(P均0.0001)。Western blot进一步证实:NF-κBp65蛋白在NSCLC组织中表达升高,IκBα蛋白表达降低。实时定量-PCR结果显示,NSCLC组织中NF-κBp65基因表达分别是癌旁肺组织的2.73±0.33倍和2.58±0.27倍(P=0.0046),而IκBα基因表达分别是癌旁肺组织的0.63±0.086倍和0.87±0.075倍(P=0.0208)。结论 NF-κBp65高表达和IκBα低表达可能在NSCLC发生过程中发挥重要作用。