IL-21增强γδT细胞体外抗肿瘤活性的实验研究

探讨IL-21对人外周血γδT细胞抗肿瘤活性的影响。分离健康人外周血单个核细胞(PBMC),分别在有或无IL-21参与的条件下,加入到含异戊烯焦磷酸(isopentenyl pyrophosphate,IPP)、IL-2或IL-15的RPMI 1640完全培养基中诱导培养γδT细胞。在培养的第10天用台盼蓝染色计数细胞;采用流式细胞术检测各组γδT细胞的纯度及γδT细胞穿孔素、颗粒酶B和CD107a的表达;用CCK-8试剂盒检测γδT细胞对K562细胞的体外杀伤效应。结果显示,不同细胞因子组诱导10d后γδT细胞纯度均达到70%以上,IL-2+IL-21、IL-15+IL-21和IL-2+IL-15+IL-21组与IL-2、IL-15组相比,细胞纯度和扩增倍数没有显著性变化;IL-2+IL-21、IL-15+IL-21和IL-2+IL-15+IL-21组γδT细胞穿孔素、颗粒酶B和CD107a的表达及对K562细胞的杀伤活性均显著高于IL-2、IL-15单独组。以上结果表明,IL-21可通过上调γδT细胞穿孔素和颗粒酶B的表达增强其抗肿瘤活性。     

人外周血γδT细胞CD107a的表达变化与细胞毒活性的关系

目的:探讨人外周血γδT细胞体外诱导过程中CD107a的表达变化及其与γδT细胞细胞毒活性的关系。方法:分离健康人外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cells,PBMCs),加入含有IL-2和异戊烯焦磷酸(isopentenyl pyro-phosphate,IPP)的培养基,体外诱导γδT细胞。分别在第7、10、14天以流式细胞仪对培养的γδT细胞进行鉴定,并同时检测其CD107a、穿孔素和颗粒酶B的表达。CCK-8试剂盒检测γδT细胞对胰腺癌细胞SW-1990的杀伤效应。采用SPSS13.0软件进行spearman相关分析。结果:在培养的第7、10、14天,γδTCR阳性细胞分别为(60.31±3.84)%、(66.45±4.25)%、(70.99±4.66)%。CD107a、穿孔素和颗粒酶B的表达在γδT细胞培养第7~10天达到峰值后呈下降趋势,第7天与第0天相比差异有统计学意义[(80.66±4.42)%、(70.11±3.34)%、(94.26±4.25)%vs(69.02±5.04)%、(62.31±4.66)%、(53.62±3.69)%,P<0.05]。培养第7天、第10天的γδT细胞对SW-1990细胞杀伤率显著高于第14天的γδT细胞[(58.86±5.12)%、(61.53±4.69)%vs(40.31±4.83)%,P<0.05]。γδT细胞CD107a表达与穿孔素、颗粒酶B、其对SW-1990细胞杀伤效应显著相关(r=0.853,r=0.785,r=0.839,均P<0.01)。结论:人外周血γδT细胞CD107a的表达与其抗肿瘤能力正相关,可能是γδT细胞细胞毒活性的一个标志。     

β-谷甾醇对人自然杀伤细胞杀伤胰腺癌SW-1990细胞的影响

目的研究β-谷甾醇对人自然杀伤(NK)细胞和人胰腺癌细胞株SW-1990增殖率和功能的影响,并探讨其可能的作用机制。方法采用本室建立的专用培养液培养NK细胞。不同浓度的β-谷甾醇作用于NK细胞及胰腺癌SW-1990细胞,四甲基偶氮唑蓝法测定β-谷甾醇对NK细胞及胰腺癌SW-1990细胞生长的影响;流式细胞仪检测胰腺癌SW-1990细胞生长周期和凋亡情况;乳酸脱氢酶法评价经不同浓度β-谷甾醇干预后,NK细胞对胰腺癌SW-1990细胞杀伤活性的变化。结果浓度为1.25～10.00μg/mL的β-谷甾醇作用48h后,NK细胞生长抑制率呈负数,较对照组明显降低(P<0.05),但浓度增加到40～80μg/mL后,NK细胞生长抑制率较对照组显著增高(P<0.05);浓度为10～80μg/mL的β-谷甾醇对胰腺癌SW-1990细胞生长有明显抑制作用(P<0.05);浓度为10μg/mL的β-谷甾醇作用后胰腺癌SW-1990细胞凋亡率为27.18%,较对照组及低浓度组明显增加(P<0.05);β-谷甾醇使SW-1990细胞周期主要停滞于S期;浓度为1.25及2.5μg/mL的β-谷甾醇作用48h后,NK细胞对胰腺癌SW-1990细胞的杀伤活性显著高于对照组(P<0.05),且在1.25μg/mL时达最高峰(76.3%);当β-谷甾醇浓度大于5μg/mL,NK细胞的杀伤活性随药物浓度的增加逐渐下降。结论β-谷甾醇能够有效提高NK细胞对胰腺癌SW-1990细胞的杀伤能力。     

舒林酸提高γδT细胞杀伤胃癌细胞机制研究

目的探讨舒林酸提高γδT细胞杀伤胃癌细胞的作用机制。方法常规方法培养γδT细胞,收集培养第9天的γδT细胞用不同浓度的舒林酸（1、2、4、8、16、32μmol／L）诱导24h,收集培养上清液用于细胞因子γ-干扰素（IFN-γ）、肿瘤坏死因子α（TNF—α）和白细胞介素12（IL-12）检测,沉淀细胞用于穿孔素、粒酶B、NKG2D流式细胞测定和用乳酸脱氢酶（LDH）释放法检测γδT细胞杀伤胃癌细胞株（SGC-7901和BCG-823）活性。每组测试样本和指标均设未加药物诱导的对照组。结果舒林酸浓度在8μmol／L时,γδT细胞穿孔素和粒酶B达最高[分别为（71．5±5．3）％和（78．3±7．1）％],明显高于对照组[分别为（51．4±7．3）％和（60．9±7．1）％]。γδT细胞经不同浓度的舒林酸诱导后培养上清液中IL—12和TNF-α浓度没有差异;舒林酸在8μmol／L时上清液中IFN-γ浓度达最高[（246．1±20．7）ng／L],明显高于对照组[（196．1±13．2）ng／L];当舒林酸浓度达32μmol／L时,γδT细胞分泌的3种细胞因子明显低于对照组,两者比较有显著性差异（P〈0．05）。γδT细胞经舒林酸诱导后杀伤SGC-7901和BCG-823细胞活性在8μmol／L时达到峰值,此时对SGC-7901和BCG-823的杀伤活性分别为（73．6±3．9）％和（76．3±3．9）％,与对照组[（60．1±3．7）％和（59．2±4．5）％]比较有明显差异（P〈0．05）。结论舒林酸诱导后γδT细胞杀伤SGC-7901和BCG-823活性明显增高的机制可能与γδT细胞表达穿孔素和粒酶B及分泌的IFN-γ有关。     

放疗联合自身免疫细胞治疗宫颈癌的临床疗效

目的:比较自身免疫细胞联合放疗与单纯放疗后宫颈癌患者的细胞免疫功能变化和生存期差异。方法:68例宫颈癌患者,放疗组38例,联合治疗组30例;分离患者外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cell,PB-MC),分别诱导培养CD3 AK细胞、CIK细胞(cytokine-induced killer cell)、树突状细胞(dendritic cell,DC)、γδT细胞和NK细胞。流式细胞术检测治疗前后患者外周血CD3+、CD4+、CD8+、CD19+、CD16+CD56+和γδT细胞的比例和数量及PBMC中穿孔素、颗粒酶B和CD107a阳性表达率。对患者进行5年随访。结果:联合治疗组大多患者生活质量均有改善,联合组卡氏评分高于放疗组(P<0.05)。联合组治疗后患者的免疫细胞绝对值显著高于放疗组(P<0.05);PBMC的穿孔素、颗粒酶及CD107 a均高于治疗前(P<0.05),并显著高于放疗组(P<0.05)。联合治疗组中,患者(Ⅰb-Ⅳ期)1、2和5年总生存率分别为93.3%(28/30)、83.3%(25/30)和76.6%(23/30),明显高于放疗组的86.82%(33/38)、68.4%(26/38)和57.9%(22/38)(P<0.05);以Ⅱb和Ⅲ期患者疗效最显著。结论:放疗联合自身免疫细胞治疗宫颈癌能提高患者的免疫功能,并延长生存期。     

不同刺激因子对人CIK细胞功能影响

本研究观察不同的细胞刺激因子共刺激对人CIK细胞增殖和功能的影响。用淋巴细胞分离液分离人外周血单个核细胞(PBMNC),按常规方法从PBMNC培养细胞因子诱导的杀伤细胞(CIK细胞),然后根据加入CD28 mAb、IL-15和IL-21将实验分为5组:对照组(CIK),CB28+IL-15+IL-21组,IL-15+IL-21组,CD28+IL-15组和CD28+IL-21组。用全自动五分类血液分析仪计数CIK细胞的增殖能力;用流式细胞术测定细胞刺激因子诱导的CIK细胞的粒酶B(granzyme B),穿孔蛋白(perforin)和CD107α等分子的变化;用ELISA法检测细胞因子IL-10、IL-12、INF-γ和TNF-α的含量;乳酸脱氢酶释放法测定细胞刺激因子共刺激的细胞对人肺癌细胞株A549(A549)、乳腺癌细胞株MFC-7(MFC-7)和人黑素瘤细胞株HME1(HME1)的杀伤活性。结果表明,在CIK细胞培养体系中加入不同的刺激因子,细胞增殖能力有明显的差异,以含CD28、IL-15和IL-21组细胞增殖倍数最高,在培养第10日时该组的增殖倍数为255.3±6.3,明显高于对照组,IL-21+IL-15组和CD28+IL-21组细胞增殖倍数分别为166.6±13.5、199.4±15.0和228.8±16.6(P<0.05),添加CD28和IL-15组则穿孔蛋白含量明显高于其他组。所有共刺激组的穿孔蛋白、粒酶B和CD107a表达百分率均明显高于对照组(P<0.05)。对A549、MFC-7和HME1细胞杀伤活性以含CD28+IL-15组最高(82.2%、59.3%和70.6%),明显高于对照组(60.9%、49.6%和48.4%)(P<0.05)。在CIK细胞培养体系中增加CD28+IL-15+IL-21组中细胞分泌IFN-γ量显著高于其他各组(P<0.05)。结论:不同刺激因子活化的CIK细胞的增殖能力、分泌细胞因子和杀伤活性有明显差异,在培养体系中增加相应的细胞刺激因子对细胞功能定向培养有一定意义。     

Gardiquimod增强人γδT细胞杀伤肿瘤细胞的研究

目的研究Toll样受体7激动剂(Gardiquimod)对人γδT细胞杀伤肿瘤作用的影响。方法以异戊烯焦磷酸法扩增人外周血γδT细胞。用不同浓度的Gardiquimod处理γδT细胞和肺癌细胞A549,MTT法检测细胞增殖情况。LDH法检测Gardiquimod处理后γδT细胞对A549的杀伤活性;流式细胞术检测处理前后γδT细胞上CD107a、穿孔素和颗粒酶的表达情况。结果 Gardiquimod在5.0~0.31μg/ml浓度可明显促进γδT细胞增殖,同时抑制A549增殖。Gardiquimod处理γδT细胞后,杀伤A549能力明显增强,且CD107a、颗粒酶及穿孔素的表达显著升高,与对照组相比,有统计学差异(P<0.05)。结论 Gardiquimod通过增高γδT细胞上的CD107a、颗粒酶及穿孔素的表达来增强其杀伤肿瘤作用。     

通过抑制STAT3磷酸化促进γδT细胞CCR5的表达

目的： 研究糖原合酶激酶-3β抑制剂4,6-二取代吡咯并嘧啶(TWS119)促进γδT细胞趋化因子受体CCR5表达的分子机制。方法：用TWS119诱导从健康人外周血中分离培养获得γδT细胞48 h后,用流式细胞仪检测γδT细胞CCR5的表达;Western blot检测GAPDH和pSTAT3的表达。结果：培养10 d后的γδT细胞纯度达到85.79%±5.01%。TWS119浓度在0~8.0 μmol/L范围内能显著促进趋化因子受体CCR5的表达,且剂量依赖性抑制STAT3的磷酸化。同时,用STAT3磷酸化抑制剂Stattic (0.5 μmol/L)预处理γδT细胞也可以促进CCR5的表达,并能协同增强TWS119促进趋化因子受体CCR5的表达。结论： TWS119通过抑制STAT3磷酸化促进γδT细胞CCR5的表达。