基于上转化发光免疫层析技术建立发热伴血小板减少综合征病毒总抗体快速检测方法

目的基于上转化发光(UPT)免疫层析技术,建立发热伴血小板减少综合征病毒(SFTSV)总抗体的现场快速检测方法。方法将SFTSV重组NP蛋白与上转化发光颗粒(UCP)偶联,制备UCP-NP免疫层析试纸条,评价该试纸条检测SFTSV总抗体的灵敏性、特异性和稳定性,并检测SFTSV血清254份,与酶联免疫法(ELISA)比较。结果该方法可在15min内完成SFTSV总抗体检测,可检测1∶500稀释度的SFTSV阳性血清,与其他出血热病毒无交叉反应,加样14d内稳定性较高。UPT免疫层析法与ELISA法检测临床血清样品一致性极高(Kappa=0.967),约登指数为0.973。结论建立了基于UPT免疫层析技术的SFTSV总抗体快速检测方法,该方法灵敏、特异,且操作简便、快速,结果稳定,适合在基层门诊和体检现场推广。     

新型冠状病毒双抗体夹心模式免疫胶体金层析方法的建立与评价

目的 建立新型冠状病毒(SARS-CoV-2)双抗体夹心模式免疫胶体金层析方法,以利于SARS-CoV-2感染的快速诊断。方法 采用2株针对重组核蛋白(nucleoprotein, NP)的单克隆抗体WT5(捕获抗体)和WT9(检测抗体),构建双抗体夹心模式免疫胶体金层析方法,并评价该方法的灵敏度、特异性、稳定性。结果 建立以SARS-CoV-2抗原为靶向分子的免疫胶体金层析方法。该方法能在10～15 min内完成对SARS-CoV-2抗原的检测,可检测病毒抗原浓度5 ng/mL以上的SARS-CoV-2阳性样本;制备的免疫胶体金层析试纸条的灵敏度和特异度分别为87.50%、99.36%,阳性预测值和阴性预测值分别为97.67%、96.27%;与鼻病毒、EB病毒、季节性流感(H3N2)无交叉反应,检测结果在1个月内仍保持较高稳定性。结论 SARS-CoV-2双抗体夹心模式免疫胶体金层析方法特异性高、稳定性好,操作简单、快捷,具备较好的快速诊断应用前景。     

抗寨卡病毒包膜蛋白单克隆抗体的制备和鉴定

目的 制备抗寨卡病毒(zika virus,ZIKV)包膜蛋白(envelope protein,E蛋白)单克隆抗体,检测其免疫反应特异性.方法 将ZIKV重组E蛋白免疫BALB/c小鼠,取小鼠脾细胞与骨髓瘤细胞用50％聚乙二醇(PEG)融合,经过含有次黄嘌呤、氨基喋呤和胸腺嘧啶的培养基筛选出阳性克隆,采取有限稀释法获得单克隆细胞株.利用筛选到的单抗作为一抗,行间接免疫荧光实验和免疫转印试验,鉴定单抗的反应特异性.结果 筛选出1株针对寨卡病毒E蛋白的单克隆抗体(命名为13E7-E9),间接免疫荧光实验和免疫转印试验结果表明,该单抗可与寨卡病毒E蛋白结合,且与登革病毒无交叉.结论 成功筛选1株抗寨卡病毒E蛋白的特异性单克隆抗体,可为研发寨卡病毒的免疫诊断试剂奠定基础.     

肠出血性大肠杆菌O157∶H7志贺毒素I型A亚基的表达与鉴定

目的表达肠出血性大肠杆菌(EHEC)O157∶H7志贺毒素1型A亚基(Stx1A)重组蛋白并鉴定。方法从EHEC O157∶H7基因组中扩增编码Stx1A的基因,经测序无误后,克隆入表达载体pET-22b(+),转化大肠杆菌BL21(DE3),经诱导、纯化获得目的蛋白Stx1A,并对纯化的目的蛋白进行质谱鉴定。重组的Stx1A蛋白免疫BALB/c小鼠,观察小鼠抗血清与EHEC O157∶H7毒株特异性反应。结果 PCR扩增的Stx1A基因为945 bp,成功构建重组质粒pET22b(+)-Stx1a,重组蛋白在原核细胞中获得高效表达,通过AKTATM-His亲和层析柱获得纯化。质谱分析表明目的蛋白为Stx1A。Western blot显示鼠抗Stx1A血清可与EHEC O157∶H7毒株产生的天然毒素蛋白结合。结论成功克隆了EHEC O157∶H7 Stx1A基因,并获得重组表达,为后续研究奠定基础。     

时间分辨荧光免疫分析法检测产志贺毒素大肠杆菌

目的基于时间分辨荧光免疫分析技术,建立高灵敏性、高特异性的产志贺毒素II(StxⅡ)大肠杆菌(STEC)全自动超微量检测方法。方法以StxⅡ单克隆抗体S1D8包被96孔板,采用双功能螯合剂异氰酸苄基二乙烯三胺四乙酸络合Eu3+标记StxⅡ单克隆抗体S2C4,以β-二酮体为主的增强液为发光增强系统。建立StxⅡ双抗体夹心时间分辨荧光免疫分析法,并其对特异性、检出限、健全性进行评估。结果建立以StxⅡ为靶标的时间分辨荧光免疫法检测STEC法,检出限为0.023μg/L,与产StxI的STEC无交叉反应;平均回收率为98.95%,批内、批间CV分别为3.5%和4.7%。该方法灵敏性和特异性分别为100.0%和97.4%,阳性预测值和阴性预测值各是92.6%和100.0%,误诊率和漏诊率则分别是2.6%和0,假阳性率和假阴性率分别是2.6%和0。TRFIA检测StxⅡ毒素的诊断符合率为98.1%;约登系数为0.974,Kappa检验u系数为0.95。结论 StxⅡ时间分辨荧光免疫分析法灵敏度高、稳定性好,具有很好的临床应用前景。     

抗寨卡病毒非结构蛋白1单克隆抗体的制备与鉴定

目的制备抗寨卡病毒非结构蛋白1的小鼠杂交瘤单克隆抗体,并对筛选获得的单抗进行抗体亚型鉴定以及免疫结合特性鉴定。方法将真核表达纯化获得的寨卡病毒非结构蛋白1按50μg/只的量免疫3只SPF级BABL/c小鼠,经过3次皮下多点免疫及1次腹腔加强免疫后测定小鼠血清抗体效价,取抗体滴度高的免疫小鼠脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞SP2/0进行细胞融合,使用有限稀释法进行亚克隆,采用间接ELISA筛选分泌高滴度单抗的杂交瘤细胞株,使用小鼠单克隆抗体分型试剂盒对筛选的单抗进行亚型鉴定,分别使用免疫印迹与间接免疫荧光法检测单抗与寨卡病毒非结构蛋白1以及寨卡病毒的免疫结合特性。结果寨卡病毒非结构蛋白1免疫刺激小鼠产生高滴度的抗体,ELISA滴度为1∶64000。通过筛选获得2株能高效分泌抗寨卡病毒非结构蛋白1单抗的杂交瘤细胞株(命名为1C9-F12,4B2-F3),分泌的单抗的亚型均为重链γ1和轻链Kappa;Western blot及IFA法检测2株单抗均能与寨卡病毒非结构蛋白1及寨卡病毒发生特异性结合。结论成功筛选到2个抗寨卡病毒非结构蛋白1的小鼠单克隆抗体,该两个单抗均具有寨卡病毒非结构蛋白1及寨卡病毒结合特性,为建立检测寨卡病毒感染的ELISA方法及治疗性抗体研究奠定了基础。     

肠道病毒71型VP1蛋白单克隆抗体的制备及初步鉴定

目的:制备肠道病毒71型(enterovirus 71,EV71)VP1外壳蛋白单克隆抗体。方法:利用重组纯化的EV71-VP1蛋白为抗原免疫BALB/c鼠,按常规杂交瘤技术进行细胞融合,对阳性杂交瘤细胞进行筛选及亚克隆,获得1株能稳定分泌抗EV71-VP1抗体的杂交瘤细胞株6F2B9,细胞体外扩大培养后的上清用Protein G柱纯化,超滤后用BCA法测其浓度,用免疫球蛋白亚类鉴定试剂盒鉴定单克隆抗体亚型,间接ELISA方法检测其效价和特异性,间接免疫荧光法检测其与EV71病毒的特异性结合能力。结果:本研究得到的抗EV71-VP1抗体DSE-136,纯化后浓度为1.9 g/L,免疫球蛋白亚类为IgG2b,轻链属于κ链;间接ELISA检测效价为1∶3.2×105;间接免疫荧光结果显示其可与EV71病毒特异性结合。结论:成功制备出1个效价高、特异性好的抗EV71-VP1单克隆抗体DSE-136,为VP1抗原诊断、疫苗研发及其效果评价奠定了基础。     

I型志贺毒素时间分辨荧光免疫分析方法的建立

目的构建基于时间分辨荧光免疫分析技术(TRFIA)的高灵敏性、高特异性的I型志贺毒素(StxI)双抗体夹心免疫检测法,用于产志贺毒素大肠杆菌(STEC)感染的临床快速诊断。方法采用两株针对StxI不同表位的单克隆抗体2F6-F8和8E7-E6,构建双抗体夹心TRFIA,并评价该方法的灵敏度、特异性以及稳定性;以PCR检测stxI基因结果为金标准,以TRFIA、ELISA、Duopath~?Verotoxins免疫胶体金检测试剂盒,检测54例StxI毒素粗提物,比较灵敏度、特异性、阳性预测值、阴性预测值和与PCR法的一致性。结果建立的以StxI为靶向分子的TRFIA,可以在2h内完成对StxI检测,检测最大稀释倍数为1:1 000的StxI阳性菌株毒素粗提物样本,灵敏度比ELISA提高了约2个数量级。Stx I的TRFIA与StxII型无交叉反应,检测结果在1个月内仍保持较高稳定性。与PCR方法相比,TRFIA灵敏度(93.8%)高于ELISA(82.4%)和Duopath~?Verotoxins免疫胶体金(57.1%),差异有统计学意义(P<0.05);其特异性(100.0%)、阳性预测值(100.0%)、阴性预测值(97.4%)均大于等于ELISA(分别为97.2%、93.3%、92.1%)和Duopath~?Verotoxins免疫胶体金(分别为100.0%、100.0%、87.0%);TRFIA检测结果与PCR一致性(Kappa=0.955)高于ELISA(Kappa=0.809)法和Duopath~?Verotoxins免疫胶体金(Kappa=0.664)。结论成功构建StxI-TRFIA快速检测方法检测样品中StxI毒素,为TRFIA在毒素检测方面的推广应用提供了依据。     

寨卡病毒非结构蛋白1的真核表达纯化和免疫反应性鉴定

目的 在HEK293F细胞中表达寨卡病毒(Zika Virus,ZKV)的非结构蛋白1(Nonstructural Protein 1,NS1),并分离纯化得到重组ZKNS1以及验证其免疫反应性。方法 根据GenBank中的ZKNS1序列合成基因,在基因上下游分别引入信号肽和组氨酸标签,通过NotI和XbaI双酶切将基因克隆至pcDNA31(+)载体;将重组载体转染HEK293F细胞,重组蛋白用镍亲和柱层析纯化;免疫印迹法(Western blot)鉴定重组ZKNS1与寨卡病毒阳性人血清的免疫反应性。结果 成功构建了ZKNS1的真核表达载体pcDNA31(+)-ZKNS1;在HEK293F细胞中重组ZKNS1以分泌形式表达于细胞培养上清中,经纯化后获得了纯度较高的分子量约为46kDa的重组蛋白;Western blot结果显示重组ZKNS1与寨卡病毒阳性人血清能发生特异性结合。结论 成功构建ZKNS1的真核表达载体,获得了免疫反应性较高的纯化的重组ZKNS1,为进一步建立ELISA检测方法及制备单克隆抗体奠定了基础。