骨髓增殖性肿瘤中JAK2V617F突变和TNF-α的表达及两者的相关性研究

本研究旨在探讨骨髓增殖性肿瘤（MPN）患者外周血单个核细胞中JAK2V617F突变和TNF-α因子的表达情况及两者之间的相关性,为临床诊断及治疗提供理论依据.选取山东大学附属省立医院血液科确诊的62名BCR-ABL阴性的MPN患者（35例ET患者,19例PV患者,8例MF患者）及15例健康成年人为研究对象,将患者及正常对照者的外周血单个核细胞分为两部分,分别提取细胞中的DNA及mRNA,并将mRNA反转录为cDNA.采用SYBR Green Ⅰ实时荧光定量PCR分别检测JAK2V617F突变及TNF-α的表达量,并分析两者的相关性.结果表明,MPN患者JAK2V617F基因突变总体阳性率为64.52％ （40/62）,其中ET患者的JAK2V617F突变阳性率为54.28％ （19/35）,PV患者的JAK2V617F突变阳性率为94.74％（18/19）,MF患者的JAK2V617F突变阳性率为37.50％（3/8）;ET、PV、MF患者的JAK2V617F突变比例分别为0.838±0.419、4.417±0.658、2.746±2.009;ET、PV、MF患者TNF-α的表达分别是正常对照的1.7、7.0、8.2倍（P＜0.05）;且JAK2V617F突变负荷与TNF-α的表达水平呈线性相关（Pearson r =0.610,R2 =0.372,P=0.005）.结论：TNF-α在BCR-ABL阴性的MPN发病机制中有重要作用,在ET、PV、MF中表达升高且表达量不同,且与JAK2V617F突变呈线性相关.     

聚合酶链反应方法检测外周血淋巴细胞HLA-A mRNA方法学的建立及在肾移植中的初步应用

目的通过建立检测宿主外周血淋巴细胞(PBL)表面HLA-AmRNA表达程度的实时荧光定量逆转录聚合酶链反应(RT-FQ-PCR)方法,检测肾移植患者移植后外周血淋巴细胞表面HLA-AmRNA的表达程度,探讨其在诊断移植后早期排斥反应的发生的价值及机体免疫状态的关系。方法以6-磷酸葡萄糖脱氢酶(G6PDH)作内参照,用Taqman探针荧光定量技术,建立检测PBLHLA-AmRNA的RT-FQ-PCR方法;并检测35例随访移植患者的不同时间的60个标本和60名正常人的阈循环数(Ct),然后用REST软件分析PBLHLA-AmRNA的表达水平。结果正常人和51个移植标本的PBLHLA-AmRNA对G6PDH的相对表达量分别为0·036±0·012和0·026±0·015(双侧t=1·981,P<0·05),提示服用免疫抑制药(目前临床用药剂量均偏大)后患者PBLHLA-AmRNA表达减弱,机体免疫状态低,无排斥反应发生但易导致感染、肿瘤等并发症的产生;其中9个移植标本的PBLHLA-AmRNA对G6PDH的相对表达量为0·042±0·017(双侧t=2·002,P<0·05),提示较其他51例移植标本患者PBLHLA-AmRNA表达增强的患者,经病例回访查询发现该5例移植患者在这期间有排斥反应(根据临床表现、肾功能检查、影像学及核医学检查的临床排斥反应期)的发生,其中1例在移植后6个不同时间的标本显示2次有增高,每次经治疗后均降低。结论建立的宿主PBLHLA-AmRNART-FQ-PCR检测方法简便、特异、重复性好、可信度高,可用于肾移植后PBLHLA-AmRNA表达水平的检测,评估机体的免疫状态,预测排斥反应的发生。     

自制质控血清的临床应用评估

目的探讨自制质控血清在肿瘤标志物及激素电化学发光分析室内质量控制中的应用价值。方法选择日常工作中甲胎蛋白、癌胚抗原等所需检测项目的高浓度标本,加至正常浓度的血清中调节各检测项目至所需浓度配成自制质控血清。自制质控血清灭活,离心、分装后置于-80?℃冰箱保存,每天取出1管于37?℃水浴溶化后,随同当日标本检测。结果在罗氏E170仪器上检测,自制质控血清稳定,控制效果良好,重复精度好。结论自制质控血清可以满足室内质控要求,且来源方便,成本低。     

SiRNA封闭MHC基因对鼠LAK细胞杀伤活性的影响

目的观察使用小干扰短链RNA(small interference RNA,siRNA)封闭BABL/C小鼠淋巴细胞MHC-Ⅰ基因(H-2K~d)对H-2K~d表达的影响及H-2K~d表达降低的淋巴因子激活的杀伤细胞(lym- phokine activated killer cell,LAK)杀伤活性的改变,探讨淋巴细胞MHC-Ⅰ在肿瘤免疫中的作用。方法在4×10~5/ml的LAK细胞的24孔培养板中分别加入H-2K~d-siRNA,单纯转染剂和无义siRNA。免疫荧光流式细胞术定量检测siRNA对LAK细胞H-2K~d表达抑制作用,LDH释放试验检测H-2K~d表达降低的LAK细胞肿瘤杀伤活性。结果流式细胞术测定结果:siRNA组H-2K~d蛋白的表达率下降(P<0.01)。LDH释放试验显示(E/T=40/1):对H22和K562肿瘤细胞的杀伤活性降低(P<0.01)。结论不同比例H-2K~d-siRNA和助转染剂均能有效抑制小鼠LAK细胞表面H-2K~d的表达,其中以1.6μg/8μL效果最佳。不同浓度的siRNA均不影响淋巴细胞增殖活性,对淋巴细胞无毒副作用。H-2K~d-siRNA通过抑制鼠LAK细胞的H-2K~d的表达,导致鼠LAK细胞对H22及K562肿瘤细胞的杀伤活性降低。说明H-2K~d是鼠LAK细胞杀伤作用的重要因子,本实验为构建H-2K~d降低的体内实验模型提供了基础。     

IL-18及其受体在特发性血小板减少性紫癜患者Th1类细胞优势应答中的作用

Objective To evaluate the role of interleukin(IL)-18 and IL-18 receptor(IL-18R)in the predominant Thl type cytokine response in patients with immune thrombocytopenia(ITP).Methods Fifteen patients with active phase ITP,eighteen in remission and thirteen healthy controls were enrolled in this study.T-bet and GATA-3 mRNA levels in peripheral blood mononueleated cells(PBMNC)were measured by reverse transcfiptase polymerase chain reaction(RT-PCR);the plasma IL-18 level by enzyme linked immunosorbent assay(ELISA),the expression of IL-18R on CD3+ lymphocytes and total lymphocytes by flow cytometry(FCM).Results The T-bet mRNA levels in patients with active phase ITP was 3.572 fold as much as that in the controls(P＜0.05),while the GATA-3 mRNA levels were 0.378 foId of that in controls(P＜O.05).The levels of plasma IL-18 and IL-18R on CD3+ lymphocytes were significantly increased in active ph8se ITP than in remission phase and controls.There was no differenee in ratio of T-bet/GATA-3 between remitted ITP and controls and so was for T-bet mRNA,GATA-3 mRNA,plasma IL-18 and IL-18R on CD3+lymphocytes.Conclusion ITP as a disease of Thl-dominant response there is an unbalance between T-bet and GATA-3 in its active phase:IL-18 and IL-18R being upregulated.     

免疫性血小板减少症患者外周血白细胞介素-18及其受体α链的表达

目的 通过检测新诊断的免疫性血小板减少症(ITP)患者用药前外周血IL-18和CD_3~+细胞表面IL-18受体α链(IL-18Rα)的表达,探讨IL-18和IL-18Rα在ITP发病中的作用机制.方法 以我院门诊及住院治疗的18例新诊断的ITP为研究对象,应用ELISA检测血浆中IL-18的含量,采用流式细胞术分析CD_3~+细胞和总淋巴细胞表面IL-18Rα的表达,应用RT-PCR检测外周血单个核细胞(PBMCs)中IL-18 mRNA、转录因子T-bet mRNA和GATA-3 mRNA的表达.选择15例与试验组匹配的健康志愿者作为正常对照组.结果 新诊断的ITP患者血浆中IL-18的含量为(468.57±141.62)pg/ml,显著高于对照组(P<0.05);CD_3~+细胞表面及淋巴细胞表面IL-18Rα的表达分别为(8.50±3.16)%和(9.16±2.98)%,两者均显著高于对照组(P<0.05);ITP患者PBMCs中IL-18 mRNA、T-bet mRNA和GATA-3 mRNA的表达分别为0.12±0.02、0.07±0.02和0.0039±0.0014,IL-18mRNA和T-bet mRNA显著高于对照组(P<0.05),而GATA-3 mRNA显著低于对照组(P<0.05),T-bet/GATA-3比例显著增高.结论 IL-18与ITP的发生发展有关,本研究从蛋白和基因水平说明IL-18和IL-18Rα可能上调ITP患者Th1类细胞的表达,通过调整T-bet/GATA-3的比例,恢复Th1/Th2的平衡,有望为ITP的治疗提供一个新的治疗策略.     

蛋白质芯片及临床应用

人类基因组排序工作的完成是人类医学史上的里程碑。基因芯片虽可在 m RNA水平上分析整个基因组表达的情况 ,但生命活动的主体是人体内存在的 1 0万种以上的蛋白质 ,发展蛋白质芯片这一高新技术已成为生物芯片领域的挑战性课题。本文仅对蛋白质芯片的基本原理、临床应用及前景等作简单介绍     

胃癌患者外周血单个核细胞HLA基因表达研究

目的探讨胃癌患者外周血单个核细胞(PBMC)HLA-A、HLA-B、HLA-DP、HLA-DR、HLA-G基因的表达水平及对胃癌的临床应用价值。方法设计HLA-A、HLA-B、HLA-DP、HLA-DR、HLA-G基因引物和实时荧光PCR相对定量法反应体系,在ABI7500实时荧光定量PCR仪上检测43例胃癌患者和22例健康人PBMC内基因表达水平并分析其差异。结果(1)胃癌患者HLA-A、HLA-B、HLA-DP、HLA-DR、HLA-G的mRNA相对表达量分别为0.71±0.26、0.61±0.37、0.91±0.33、0.90±0.38、0.77±0.27。健康组分别为1.23±0.60、1.17±0.60、1.07±0.68、1.12±0.55、0.98±0.37。与健康组相比,胃癌患者HLA-A、HLA-B、HLA-G表达水平降低,差异有统计学意义。HLA-DP和HLA-DR则无明显差异。(2)在不同分化的胃癌患者中,HLA-A、HLA-B、HLA-DP、HLA-DR和HLA-G的mRNA表达水平无明显差异。胃癌Ⅰ期+Ⅱ期的HLA-G表达水平高于Ⅲ期+Ⅳ期,差异有统计学意义。不同分期的HLA-A和H...     

小鼠LAK细胞MHC表达水平对其体外杀伤肿瘤活性的影响

目的探讨LAK细胞表面MHC的表达水平与体外肿瘤细胞杀伤活性的关系。方法使用siRNA沉默小鼠LAK细胞MHC-Ⅰ(H-2Kd)分子的表达,同时设空转染组和无关序列组,流式细胞仪检测不同组别靶蛋白的表达,LDH释放试验检测H-2Kd表达降低的LAK细胞对K562和H22肿瘤细胞株的杀伤活性。结果流式细胞检测证实siRNA能够抑制靶蛋白的表达,H-2Kd表达降低组对K562和H22肿瘤细胞的杀伤活性与对照组相比明显降低,空转染组和无关序列组与对照组无显著性差异。结论小鼠脾LAK细胞表面H-2Kd的表达水平与其体外杀伤活性相关。     

H-2Kd基因siRNA表达质粒的构建及在小鼠LAK细胞的表达

目的构建针对BALB/C小鼠H-2K^d基因siRNA表达质粒，观察其在小鼠LAK细胞的表达，为进一步研究H-2K^d基因功能奠定基础。方法设计siRNA干涉靶序列，体外合成两段互补的寡核苷酸，通过与线性化的pSilencer 3.0-H1连接,转化大肠杆菌DH5a扩增纯化得到所需质粒,通过琼脂糖凝胶电泳及基因测序鉴定其分子量及插入片段的序列。采用siRNA表达质粒封闭小鼠LAK细胞MHC-I（H-2K^d）的表达，同时设空转染组和无关序列组，流式细胞术检测不同组别靶蛋白的表达。结果纯化的质粒分子量为2.8Kb,插入的寡核苷酸序列与设计的序列完全相符, 流式细胞术检测证实siRNA能够抑制靶蛋白的表达。结论成功构建了针对H-2K^d基因的siRNA表达质粒并抑制了其表达。