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目的脑膜炎大肠埃希菌(E.coli)侵袭素IbeA通过与脑微血管内皮细胞表面受体结合,从而介导细菌穿透血脑屏障引起新生儿细菌性脑膜炎。为通过肽库筛选获得与IbeA蛋白结合的多肽,建立噬菌体随机肽库筛选IbeA结合多肽模体的方法。方法首先制备靶分子,用PCR扩增出全长ibeA基因序列,克隆至表达载体pET28a中,转化大肠埃希菌BL21(DE3).经IPTG诱导表达出带有His-tag的目的蛋白,经变性复性后通过Ni^2+-NTA亲和层析柱得到纯度达90%的重组蛋白。然后以固相化IbeA重组蛋白为靶亲和筛选噬菌体线性12肽库。结果经过3轮淘选,得到能和IbeA结合的24个重组噬菌体克隆;挑选15个亲和力高的克隆进行DNA测序,对比分析所得的短肽序列。固相Fmoc法合成短肽,并进行结合实验、阻断实验和竞争抑制实验。绪论以重组表达的IbeA融合蛋白为靶筛选得到的重组噬菌体十二肽克隆,能够和IbeA蛋白结合,为IbeA蛋白结合多肽。结果提示所筛选的阳性噬菌体克隆及其合成肽可能模拟IbeA受体表位的结构。 相似文献
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抗HIV-1 gp41 合成多肽C34单抗的制备及生物学活性 总被引:1,自引:3,他引:1
目的 制备针对C34和C46单抗,并以此为工具研究gp41表位,进一步了解HIV-1包膜蛋白的作用机理和病毒的感染机制,为寻找新的治疗靶点提供抗体工具。方法 常规动物免疫、细胞融合、克隆化制备抗C34和C46的单克隆抗体,并鉴定其特异性位点,还用ELISA法、MTTI法及荧光分子探针技术对单抗的生物学活性进行研究。结果 获得了3株抗C34单克隆抗体、2株抗C46单抗。此5个单抗均与C34结合,并抑制N36肽与C34肽复合物的形成;其中效价最高的1G1对H9/HIVⅢB细胞的生长有刺激作用,对H9/HIVⅢB细胞和MT-2细胞的融合无明显影响。结论 得到5株可与C34反应,并可抑制C34与N36多肽结合的单抗,其中1G1所识别的表位可能为增强性或刺激性表位。 相似文献
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目的:筛选并鉴定HIV-1 gp4l核心表位。方法:用识别HIV-1 gp41的构象特异性单克隆抗体NC-1筛选噬菌体12肽库,通过夹心ELISA、NC-1特异性阻断实验、竞争抑制实验鉴定阳性噬菌体克隆,DNA序列分析阳性克隆。结果:经3轮筛选,随机挑取24个噬菌体克隆,ELISA鉴定表明有lO个克隆可与NC-1结合,DNA序列分析并推导氨基酸序列,共5种序列:HDVHHRWVYLLS、ITVNEWLYTSEQ、HGRSHGMFKPKR、MGPIARPHWHLN、DMYRSPRPKPDT。其中gp41N肽和C肽所形成的复合物可特异性阻断表达HDVHHRWVYLLS,VNEWLYTSEQ和MGPIARPHWHLN的克隆与NC-1的结合。结论:所得序列HDVHHRWVYLLS,VNEWLYTSEQ及MGPIARPHWHLN模拟HIV-1 gp41六螺旋束核心表位。 相似文献
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目的:确定IL-2Rα表位,为研制高效特异性强的小分子肽类免疫抑制剂奠定基础。方法:用抗IL-2Rα单克隆抗体5GI对噬菌体六肽库进行筛选,选择出与5GI结合较强的克隆,经DNA序列分析,获得保守序列。对含保守序列的克隆进行生物学活性鉴定。结果:选择出31个与5GI结合较强的克隆。获得Ser-Ser-Arg两种保守序列。生物学活性鉴定表明:含Ser-Ser-Arg序列克隆较含Ser-Ser-Phe 相似文献
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目的获得模拟脂多糖抗原表位的噬菌体环状展示肽。方法用抗鼠伤寒菌脂多糖单克隆抗体2F4为靶分子,亲和筛选噬菌体随机环七肽库,双夹心ELISA及特异性抗原抑制试验鉴定阳性克隆。结果经三轮筛选,随机挑选38个克隆,其中34个克隆显示与2F4结合。鼠伤寒沙门氏菌脂多糖可抑制噬菌体克隆与2F4结合,所有克隆的半数抑制浓度为(0.125~0.250)μg/ml。挑选10个克隆测序并推导氨基酸序列,其中7个克隆出现P-X-WAS-X-W保守序列;10个序列中非极性氨基酸含量平均值为71.4%。结论噬菌体展示环七肽可模拟鼠伤寒沙门氏菌脂多糖抗原表位。 相似文献
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作用于gp41的HIV融合抑制剂高通量筛选方法的研究 总被引:7,自引:3,他引:4
目的 对作用于gp4 1的HIV融合抑制剂筛选方法进行研究和改进 ,使其成为更加简便的高通量药物筛选模型。方法 采用夹心ELISA方法 ,检测HIVgp4 1六股α 螺旋束的形成。结果 以特异性识别HIVgp4 1六股α 螺旋束的单克隆和多克隆抗体为基础建立的改良夹心ELISA方法 ,特异性好 ,准确性高 ,更为简便和经济 ,能稳定有效地检测样品对 gp4 1六股α 螺旋束形成的抑制作用。 结论 本研究建立的改良方法可作为高通量药物筛选方法 ,用于从中草药库、噬菌体肽库和微生物发酵液等复杂组分样品中筛选作用于 gp4 1的HIV融合抑制剂 ,以研究开发抗HIV药物 相似文献
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交叉保护性抗LPS多克隆抗体的制备与LPS多表位模拟肽的筛选 总被引:6,自引:0,他引:6
目的 获得具交叉保护性的抗细菌脂多糖(LPS)多克隆抗体与模拟LPS多表位的噬菌体展示环肽克隆。方法制备具交叉反应性的兔抗鼠伤寒沙门菌抗血清,鉴定抗血清对大肠杆菌和铜绿假单胞菌攻击小鼠的交叉保护性。以亲和纯化的多克隆抗体为靶,亲和筛选噬菌体随机环七肽库。双夹心ELISA和竞争抑制ELISA鉴定阳性噬菌体克隆。结果兔抗血清能与多种来源的LPS反应,对用大肠杆菌和铜绿假单胞菌攻击的小鼠有显著的保护性。用亲和层析纯化的多克隆抗体为靶分子进行3轮筛选,随机挑选46个克隆,其中20个克隆显示与多抗结合。鼠伤寒沙门菌LPS可抑制阳性噬菌体克隆与多抗结合,所有克隆的IC50(达到50%抑制率的LPS浓度)为125ng/ml。挑选其中10个克隆测序并推导氨基酸序列,其中5个克隆具X-QFYP-X-A保守序列;3个克隆具LFTFAHY序列;2个克隆具YQYYPAA序列,所有序列非极性氨基酸含量平均值为80.0%。结论获得能与多种LPS反应且具交叉保护作用的兔多克隆抗体,筛选得到可模拟鼠伤寒沙门菌LPS多表位噬菌体展示环七肽。 相似文献
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目的:确定IL-2Rα表位,为研制高效特异性强的小分子肽类免疫抑制剂奠定基础。方法:用抗IL-2Rα单克隆抗体5G1对噬菌体六肽库进行筛选,选择出与5G1结合较强的克隆,经DNA序列分析,获得保守序列。对合保守序列的克隆进行生物学活性鉴定。结果:选择出31个与5G1结合较强的克隆。获得Ser-Ser-Phe和Ser-Ser-Arg两种保守序列。生物学活性鉴定表明:含Ser-Ser-Arg序列克隆较含Ser-Ser-Phe被抑制效果好。结论:Ser-Ser-Arg是IL-2Rα表位的关键序列。以此表位序列合成的小分子肽可作为IL-2Rα的拮抗剂而成为免疫抑制剂。 相似文献