抗SARS冠状病毒中和活性单克隆抗体的筛选及其结合位点分析

目的 建立能分泌具有中和活性的抗SARS-CoV单克隆抗体（McAb）细胞株，制备有中和活性的抗SARS-CoV MeAb，用于SARS-CoV感染的早期特异诊断和进行SARS-CoV结构蛋白的功能研究。方法 用灭活纯化sARS-c0V（BJ01株）免疫BALB／c小鼠，通过细胞融合技术，建立能稳定分泌SAILS病毒MeAb的杂交瘤细胞系，然后用中和试验进一步筛选分泌具有中和活性的抗SARS-CoV MeAb细胞株。利用SARS-CoV的S和N蛋白的不同长度肽段通过EusA鉴定McAb的特异结合区域，分析S和N蛋白不同区域诱导产生抗体的能力和特性。结果 建立了12株能稳定分泌抗SARS-CoV McAb的杂交瘤细胞株，间接免疫荧光法检测抗体效价在1：320～1：20 480之间，其中6株具有较好的中和SARS-CoV的能力。具有中和活性的McAb中，3株是针对S蛋白的，2株是针对N蛋白的。其中抗S蛋白的中和抗体活性比抗N蛋白的中和抗体活性高，另外1株可能是针对SARS-CoV的其他结构蛋白的。进一步对6株抗S蛋白的McAb的特异抗原结合表位分析，发现其中3株结合位点在S蛋白第12～311氨基酸之间，2株在第310～535氨基酸之间，后者中和效价高于前者，另1株是针对S2蛋白的，SARS病毒的受体结合区正位于第310～535氨基酸这一区段。具有中和活性的McAb通过间接免疫荧光、ELISA、酶标免疫组化法和胶体金方法对SARS病毒进行检测，都显示出高度的特异性和良好亲和力。结论 成功制备了具中和活性的抗SARS-CoV单克隆抗体，并分别测定了McAb对S蛋白和N蛋白的特异抗原结合活性，初步确定了S蛋白的中和表位。为今后SARS病毒的特异诊断、结构蛋白的功能分析和重组疫苗的研制奠定了较好的基础。     

人源H5N1亚型禽流感病毒株空斑特性和致病性研究

目的观察不同H5N1亚型禽流感病毒株空斑特性,对比研究不同空斑类型H5N1病毒致病性和复制能力差异。方法将不同稀释度的H5N1亚型禽流感病毒株分别接种于MDCK单层细胞,加盖营养琼脂,合适时间染色,观察不同H5N1亚型禽流感病毒株空斑形成特点,按照DullbeccoR的方法计算病毒PFU数;根据空斑大小进行挑选、纯化、筛选不同类型空斑病毒,测定这些病毒对Balb/c小鼠致病性差异和在MDCK细胞上复制差异。结果野生的人源H5N1禽流感病毒株在空斑形成上都存在不同程度的不均一性,空斑大小、形状差异明显:A/Vietnam/1194/2004(H5N1)以大圆形斑为主,夹杂少量小点状斑。A/Beijing/01/03(H5N1)大多数为中等大小空斑,并有少数针尖状斑。野生A/Vietnam/1194/2004经过分离纯化后,得到的两种空斑类型病毒在致病性和复制能力存在明显差异。结论野生的人源H5N1禽流感病毒株在空斑形成上都存在不同程度的不均一性,从野生病毒株中分离、纯化的大小斑病毒在致病性和复制能力上存在明显差异。     

猪瘟病毒E2蛋白重复多表位基因的融合表达及其兔体免疫保护研究

目的：研究猪瘟病毒(CSFV)E2蛋白重复多抗原表位基因的融合表达及其免疫攻毒保护作用。方法：应用PCR方法扩增猪瘟病毒E2蛋白重复多抗原表位基因，构建重复多表位基因的原核重组表达质粒PGEX-3E，进行融合蛋白的表达和纯化。ELISA和Western blot方法测定单表位融合蛋白GST-E和多表位融合蛋白GST-3E与猪抗CSFV的阳性血清和兔抗E2阳性血清的反应性，并进行融合蛋白的兔体免疫及免疫攻毒保护的比较研究。结果：分子克隆和构建了原核重组表达质粒pGEX-3E，表达和纯化了融合蛋白GST-3E；单表位融合蛋白与重复多表位融合蛋白均能够与猪抗CSFV的阳性血清反应和兔抗E2的阳性血清产生免疫反应。在刺激兔体产生抗体方面，单表位融合蛋白刺激兔体产生抗体的能力较弱，而多表位融合蛋白则能够使兔体产生高效价的抗体。接种100MID50剂量猪瘟兔化弱毒(HCLV)进行的兔体免疫攻毒保护试验表明，空白对照组和载体蛋白GST免疫组无保护作用，单表位融合蛋白免疫组具有一定的免疫保护作用，而重复多表位融合蛋白免疫组则完全能够抵抗猪瘟病毒的攻击。结论：猪瘟病毒E2蛋白重复多表位的融合表达具有免疫保护作用，本实验的成功完成为猪瘟病毒多表位抗原的串联及多表位疫苗的研究奠定了基础。     

1株保存的马雅罗病毒基因组序列测定及分析

目的对保存的WJBC株马雅罗病毒(MAYV)基因组序列进行测定,阐明其与已报道毒株的关系及追溯其可能来源。方法将MAYV基因组编码区分10段进行RT-PCR扩增,扩增产物直接进行测序,非编码区采用RACE法进行扩增,扩增产物纯化并连接pGEM-T easy载体后转化大肠杆菌DH5α感受态细胞,挑取阳性克隆鉴定后进行测序,用DNAStar软件将测序结果拼接得到基因组序列。下载MAYV核苷酸序列,利用MEGA5.0软件构建系统进化发生树。结果与结论 WJBC株MAYV基因组核苷酸(nt)共11 429 nt,编码3679个氨基酸,其中5’端的2/3基因组编码4种非结构蛋白nsP1,nsP2,nsP3,nsP4;3’端的1/3基因组编码5种结构蛋白C、E3、E2、6K和E1蛋白。结构基因和非结构基因之间有26 nt的连接区为非翻译区。病毒基因组5’端和3’端分别有76、290 nt的非编码区。进化树结果显示,WJBC株马雅罗病毒与TRVL4675株MAYV亲缘性最高。     

利用基因芯片技术对一种未知病毒的筛查与鉴定

目的利用本研究室已建立的人类医学病毒属水平基因芯片筛查技术及主要虫媒病毒基因芯片检测技术，对2006年7月从山西临沂地区猪脑组织中分离到的未知病毒进行筛查与鉴定，确定其病原体。方法从猪脑组织中分离到病原体，接种金黄地鼠肾细胞（BHK21细胞），能产生细胞病变（cytopathic effect，CPE）。收集病毒感染的细胞上清，提取RNA，经逆转录及随机引物PCR扩增后，与医学病毒属水平基因芯片进行杂交，初步确定其所在的病毒属之后，再与主要虫媒病毒基因检测芯片进行杂交，进一步将病毒鉴定到种。通过与其他鉴定结果相比较，确定其检测特异性。结果与医学病毒属水平基因芯片杂交结果显示，该病原体属于黄病毒属病毒。结合流行病学调查分析，该病毒可能是一种虫媒病毒，因此进一步与主要虫媒病毒基因芯片杂交，基本可以判断该病原体为乙型脑炎病毒，与本室PCR及基因序列测定结果一致。结论本研究室所建立的基因芯片筛查与鉴定技术可初步应用于对未知病毒的鉴定，为未知病毒性病原体的确定提供了一种新的技术方法。     

H5N1禽流感病毒实验室检测方法灵敏性比较

目的 比对实验室常用的H5N1禽流感病毒检测方法灵敏性.方法 增殖H5N1病毒,蚀斑技术定量待检病毒,应用细胞接种、血凝实验、RT-PCR、Real-time RT-PCR等方法检测稀释的病毒悬液,比较检测的最低滴度.结果 细胞接种、Real-time RT-PCR、RT-PCR及血凝实验能检测病毒的最低滴度为10 PFU/mL、10 PFU/mL、10(3)PFU/mL及3.52 × 10(5)PFU/mL.结论 几种检测方法比较而言,细胞接种与Real-time RT-PCR枪测灵敏性最高;血凝实验用时最短,但灵敏性低,结果 需要进一步确认;RT -PCR用时较较短,检测灵敏性较高.     

人禽流感HSN1病毒HA1蛋白抗原表位及主要免疫功能区特征的研究

目的 确定人禽流感H5N1病毒HA1蛋白的单克隆抗体(McAb)抗识别表位及主要免疫功能区.方法 将16条人禽流感H5N1病毒HA1基因重叠片段克隆入真核表达载体pDisplay,构建表达HA1蛋白的重叠肽段重组质粒,转染HeLa细胞后制备细胞抗原片.利用灭活的H5N1病毒免疫BALB/C小鼠,制备病毒特异单克隆抗体(单抗)和多克隆抗体(多抗),采用间接免疫荧光法分析单抗、多抗与HA1肽段的反应性.确定HA1蛋白的单抗识别表位及主要免疫功能区.结果 成功克隆、表达了16条不同长度的H5N1肽段,并制备、获得30株分泌抗H5N1型禽流感病毒McAb的杂交瘤细胞株,其中18株为抗HA的单抗,18株中有6株单抗具有中和病毒活性.利用表达的H5N1肽段对单抗识别表位进行分析,初步确定3B5、3D1、3132、M6、M3等18株McAb识别表位区域分别位于氨基酸残基aa133-143、aa155-165、aa166-196、aa166-176、aa34-66及aa296-328之间,其中3B5、3D1、3B2、M6等McAb识别表位为序列依赖型表位,M3和M7等具有中和活性的McAb识别表位为构象性中和表位.结论 利用制备的H5N1病毒特异性McAb和表达的病毒HA1蛋白重叠肽抗原,初步确定了18株抗HA McAb的识别表位和HA1蛋白的主要免疫功能区,为进一步研究开发新型疫苗提供了重要理论依据.     

5种虫媒病毒悬浮芯片检测方法的建立

目的建立同时检测1~4型登革病毒、乙型脑炎病毒、西尼罗病毒、森林脑炎病毒和黄热病病毒等5种虫媒病毒的悬浮芯片检测方法。方法根据GenBank发表的上述病毒的序列,通过生物信息学分析和参考相关文献,在黄病毒属高度保守的NS5区设计属通用引物和种特异检测探针。将探针共价交联到不同的Luminex色标微球上,利用属通用引物进行RT-PCR扩增,与混合微球杂交,最后利用Luminex200仪器分析荧光强度值。结果将平均荧光强度的判定阈值定为背景对照的两倍可以对这5种共8型病毒进行有效鉴定。通过多批次的实验,均能准确鉴定出上述5种病毒,没有出现交叉反应,且批次间的平均荧光值偏离不大,变异系数(CV)均小于8%,表明本方法的特异性和稳定性均较好。在空斑滴定病毒的基础上,对本方法的检测敏感性进行了验证,结果表明对乙脑和黄热病病毒的检测敏感性可达到1.4个PFU,对西尼罗病毒可达14个PFU。进而将本方法用于检测55份临床标本和传代标本,其检测结果和种特异RT-PCR方法相比,具有很高的一致性,而且其在混合样本的快速检测中具有显著的优势。结论通过设计合适的引物和探针,成功建立了可同时检测和分型5种虫媒病毒的悬浮芯片方法,为疾病的诊断和预防以及流行病学调查提供了新的手段。     

骨盆区创伤性腹膜后大血肿25例分析

骨盆区创伤性腹膜后大血肿 (以下简称血肿 )常为突发性直接暴力作用于骶髂、骨盆区所致。导致血肿的直接原因是骨盆骨折 ,血肿是骨盆骨折的局部表现 ,而不是独立的疾病。血肿本身无特异性 ,其临床表现常被骨盆脏器并发伤所掩盖。加之缺乏有效的辅助检查 ,诊断困难 ,易导致误诊     

从棘突蛋白基因重组探讨严重急性呼吸综合征冠状病毒的来源

目的：探讨SARS冠状病毒（SARS-CoV）的起源。方法：运用生物信息学的方法，比较不同SARS样冠状病毒之间的异同，着重分析蝙蝠所携带的SARS样冠状病毒（SL-CoV）跨越种属屏障传播的可能性。结果：除编码棘突蛋白（S蛋白）基因外，SARS-coV与蝙蝠SL-CoV间编码结构蛋白的基因与编码复制酶的基因相似程度均很高；而S基因的差异主要集中在S1片段，且该片段的C,C含量与SARS-CoV基因组的C,C含量明显不同。进一步分析表明，由S1片段构建的冠状病毒进化树与由S2片段构建的进化树存在拓扑结构上的不平行性。结论：人类SARS病毒可能来源于蝙蝠SL—CoV，但在S基因内发生了基因重组事件，从而导致其获得跨越种属屏障传播的能力。