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目的:膜研究膜型-1基质金属蛋白酶(MT1- MMP)反义RNA对人胃癌细胞BGC823靶基因表达和侵袭特性的影响方法:利用基因重组技术构建人MT1-MMP反义RNA真核表达载体,转染人胃癌细胞BGC823,应用RT-PCR、MTT、明胶酶谱和体外侵袭实验等方法观察人胃癌细胞BGC823转染前后,MT1-MMP mRNA表达水平、细胞生长、明教酶A活性及细胞体外侵袭能力等指标的变化.结果:成功构建了MT1-MMP反义RNA真核表达载体pasMMP14,将其转染胃癌细胞BGC823后,与阴性对照组相比,实验组MT1- MMP mRNA表达水平降低,抑制率为36%.转染48 h,明教酶A的活化受到了明显抑制.转染72 h,细胞增殖明显受抑(t=2.358,P<0.01 vs空白组:t=2.727 P<0.01 vs阴性组).实验组的穿膜细胞数明显低于空白对照组和阴性对照组(t=5.744,P<0.01;t=5.695,P<0.01).结论:反义RNA对人胃癌细胞MT1-MMP基因表达和侵袭能力具有明显的抑制作用,MT1-MMP基因可作为胃癌抗侵袭治疗的分子靶点. 相似文献
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目的:利用双向启动子型RNA干涉载体pRHU构建随机RNA干涉文库.方法:分别构建基于pRHU载体的绿色荧光蛋白EGFP和p53的干涉质粒,验证双向启动子型RNA干涉载体的可用性.设计合成满足pRHU载体特点的干涉文库随机模板,经PCR扩增克隆入pRHU载体,转化感受态细胞获取随机干涉文库.随机挑选20个菌落测序,评价随机文库质量.结果:双向启动子型RNA干涉载体pRHU能在哺乳动物细胞中对外源基因EGFP和内源基因p53进行有效的干涉,表明该载体是一个有效的干涉载体,可以用于构建随机RNA干涉文库.本研究采用的构建策略可在较短时间内,用50 μg pRHU载体获得4×106个克隆.随机挑选20个克隆测序结果表明均插入了GN17-19序列,并且不存在序列重复性.结论:采用本研究的构建策略可以简便快速地利用双向启动子型干涉载体成功构建随机RNA干涉文库,为进一步筛选功能基因奠定了基础. 相似文献
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目的:建立一种简便、快速检测应激诱导细胞生成的5′端转移RNA( tRNA)半分子的方法。方法提取应激诱导细胞RNA,用poly( A)加尾酶在RNA分子3′端加尾后,加入与待测tRNA的3′端部分序列互补的简并DNA探针杂交,经RNase H消化与DNA探针互补的tRNA序列,再由oligo( dT) n锚定引物进行逆转录获得互补DNA( cDNA),以5′端tRNA半分子和锚定引物的序列为PCR反应的上下游引物,PCR扩增检测5′端tRNA半分子。结果经poly( A)加尾-RNaseH消化-RT-PCR-电泳等步骤,可以实现对5′端tRNA半分子的检测分析。结论 poly ( A)加尾-RNaseH消化-RT-PCR法的建立实现了5′端tRNA半分子的简便、快速检测分析,为tRNA半分子生物学功能研究和检测分析提供了工具。 相似文献
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一种高效T载体的构建及其对人端锚聚合酶HPS结构域的克隆 总被引:2,自引:0,他引:2
目的:制备一种高效T载体,并检测其克隆PCR产物的效率。方法:构建质粒pGH-T,它包含2个Xcm Ⅰ酶切位点,并在两位点间插入一段约600 bp的DNA序列。用Xcm Ⅰ彻底消化质粒pGH-T后,回收线性化大片段,即得T载体。利用此T载体克隆人端锚聚合酶(tankyrase)HPS结构域的PCR产物,并用限制酶切鉴定克隆的结果。结果:自制T载体可高效克隆PCR产物,其效率可达80%~100%。结论:自制T载体对PCR产物的克隆效率与商品完全相同,但使用方便且价格低廉。 相似文献
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目的:利用AdEasy系统构建miR-195的腺病毒表达载体,为研究miR-195的功能提供条件.方法:将miRNA-195前体序列从已构建的pcDNA-miR-195载体中克隆进穿梭载体pAdTrack-CMV,通过与骨架载体pAdEasy-1在大肠杆菌BJ5183中高效同源重组,获得完整的重组腺病毒质粒.利用HEK293细胞包装并扩增重组腺病毒Ad-195.Ad-195感染肺癌细胞A549后,利用miRNA的定量RT-PCR技术检测Ad-195在细胞中表达miR-195情况.随后荧光素酶报告基因实验证明,Ad-195表达的miR-195能够作用于BCL2基因上预测的miR-195靶位点.结果:实时定量PCR检测显示,Ad-195感染肺癌细胞A549后,miR-195表达水平有显著的上调.结论:miR-195的腺病毒表达载体构建成功,能够用于在细胞内过表达具有生物学功能的miR-195. 相似文献
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microRNA(miRNA)是一类长度为22~25个核苷酸的小RNA,这类非编码的小RNA分子在转录后水平上特异性地调节基因的表达.研究表明,miRNA可调控在细胞周期进程中直接或间接发挥作用的蛋白质分子;其表达水平的改变会使得细胞周期进程失去控制从而导致肿瘤的发生.此外,miRNA可分别作为癌基因和抑癌基因发挥作用从而参与细胞周期进程的调控,尤其是对细胞周期检查点的调控;它们通过协同调控多个靶基因参与细胞周期进程. 相似文献
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目的探讨不同缺氧条件对HepG2细胞中miR-210表达水平的影响。方法采用CoCl2、物理缺氧以及Na2SO3 3种不同的缺氧条件诱导HepG2细胞,利用实时定量PCR技术检测不同缺氧模式诱导前后HepG2细胞miR-210等表达变化。结果 3种缺氧模式均可以诱导HepG2细胞miR-210表达上调,其表达与CoCl2及Na2SO3的浓度有剂量依赖关系。结论 CoCl2、物理缺氧以及Na2SO3 3种不同的缺氧条件均可以有效诱导HepG2细胞中miR-210的表达上调,3种模型均可用于缺氧诱导miRNA研究,同时进一步证明miR-210表达上调是由于细胞缺氧所致。 相似文献