采用银染技术检测聚丙烯酰胺凝胶中的蛋白质

在聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)中常用的染色方法是考马斯亮蓝R-250或G-250(Coomassie brilliant blue)染色法。此法虽然应用方便,但不够敏感。近年来Switzer等人(1979)报道了一种操作简便,比考马斯亮蓝染色效果敏感100倍的银染技术。其最低检出浓度为0.0001μg/mm~2,即达到毫微克的水平,与放射性同位素检出的水平相近,故对一些浓度较低的标本不需浓缩便可直接做分析,如临床上用于血清、蛋白尿、脑脊髓液等蛋白成分的检出,此外也可用于蛋白质多肽肽图及核酸(DNA,RNA)等的分析。     

登革3型病毒prM-E和NS1多基因重组质粒DNA免疫原性增强效果观察

目的　观察登革 3型病毒的prM E和NS1基因重组质粒DNA混合免疫对免疫原性的增强作用 ,为登革DNA疫苗混合免疫提供实验依据。方法　将登革 3型病毒的prM E和NS1基因重组质粒DNA分别混合及单独免疫BALB/c小鼠 ,采用中和试验及MTT法检测免疫小鼠血清中和抗体及脾细胞特异性CTL(cytotoxicT lymphocytes)杀伤率。结果　混合重组质粒DNA免疫组与单一prM E基因重组质粒DNA免疫组均在末次免疫后第 14天检测到中和抗体 ,在第 33天达到高峰 ,为 1∶32。在末次免疫后第 4 1天 ,当效靶比为 4 0∶1时 ,混合重组质粒DNA免疫组的特异性CTL杀伤率为 15 % ,而 2个单质粒DNA组分别为 10 .9%和 12 .4 %。结论　重组质粒DNA混合免疫可同时诱发小鼠产生体液免疫和细胞免疫 ,而且细胞免疫应答具有一定的增强作用 ,但没有出现特异性CTL杀伤率的协同增强效果。     

应用长链RT-PCR法扩增我国登革2、4型病毒株全长cDNA

目的：采用长链RT-PCR技术扩增登革2型及4型病毒基因组全长cDNA，为构建登革病毒全长cDNA克隆、表达，深入阐明致病机理及探索新型疫苗奠定基础。方法：根据已测定的登革2、4型病毒全基因组序列，设计上下游引物。从感染登革病毒的乳鼠脑中提取病毒基因组RNA，采用长链RT-PCR技术进行扩增。为检验扩增产物的特异性，以PCR产物为模板扩增覆盖基因组的10个片段。将含有复杂二级结构的5′非编码区扩增片段，在377A型自动测序仪进行序列分析。结果：扩增出登革2、4型病毒基因组全长近11kb cDNA分子，非编码区测序结果表明扩增产物为登革2、4型病毒所特有。结论：利用长链RT-PCR首次成功扩增出登革病毒全长cDNA分子。     

SETD2在恶性胸膜间皮瘤中的表达与临床意义研究

目的:分析恶性胸膜间皮瘤（MPM）基因突变概况和高频突变基因的表达水平,筛选出影响MPM患者预后的关键分子和临床病理因素。方法:于2020年3月,分别从癌症基因组图谱（TCGA）数据库和人类肿瘤相关基因表达汇编（GEO）数据库下载86例MPM组织的基因二代测序数据和89例MPM组织样本的基因芯片表达数据,收集相关体细胞...     

重要呼吸道病毒病原的多重RT-PCR检测

目的 建立一种可同时快速检测引起人呼吸道感染的重要病毒病原的检测方法。方法 通过对PCR反应条件的优化,建立同时检测甲型流感病毒（IA）、呼吸道合胞病毒（RSV）和SARS冠状病毒（SARS CoV）的多重RT-PCR方法。结果 该法可同时或分别扩增IA258bp、RSV348bp和SARS-CoV438bp的基因片段。检测的敏感性分别为10^17TCID50／ml、10TCID30／ml和10^1.5。TCID50／ml。采用相同的反应体系和条件,分别对其他7种呼吸道病毒（包括乙型流感病毒,副流感病毒2型,柯萨奇病毒B3和B5血清型及腺病毒2、3和7血清型）进行扩增,均未检测出扩增产物。结论此种多重RT-PCR法可在6h内完成,适用于三种重要呼吸道病毒的快速甄别。     

登革2型病毒全长cDNA克隆定点诱变的OL-PCR方法

目的 对带有登革2型病毒（DEN-2）全长cDNA的质粒pDVWS501上E62、E203位点进行定点诱变。方法 设计4对点诱变引物,运用OL-PCR（overlapPCR)法,扩增出分别在E62或E203位带有点突变的2条DNA片段,克隆至T载体,获T-TB62、T-TB203两个克隆,将T-TB62用ClaⅠ和SphⅠ分别酶切,T-TB203用SphⅠ NheⅠ酶切后,用T4连接酶分别连接至pDVWS501,获重组质粒TB62和TB203。对TB62和TB203进行序列测定。结果 成功得到分别在E62、E203位带有点突变的TB62、TB203克隆。结论 OL-PCR法是具有较高突变效率的定点诱变方法。     

三种代血浆分子量的分析超离心鉴定

运用分析超速离心方法分别测定每个代血浆样品的沉降系数(S值)和扩散系数(D值),用最小二乘法对数据处理后,代入Svedberg方程,求出它们的重均分子量。罗氏海星明胶分子量为8,000,木瓜胶分子量12,000,驴皮胶分子量44,600。     

一株西尼罗病毒基因组cDNA亚克隆的构建与鉴定

目的：构建我室保存的一株西尼罗病毒引进毒株（CH-01）基因组全长cDNA的亚克隆，为进一步构建该毒株的感染性全长cDNA克隆奠定基础。方法：根据CH-01病毒株基因组序列中含有的特异性酶切位点，利用DNAstar及Olig06软件设计5对引物。以感染细胞中的病毒RNA为模板，通过RT-PCR扩增出覆盖病毒基因组全长的5个cDNA片段，并分别将其克隆至pGEM-Teasy载体，通过片段间共有的酶切位点进行连接，最终获得基因组5′和3′半分子，并分别通过序列测定加以鉴定。结果与结论：已构建出西尼罗病毒CH-01株基因组的5′和3′半分子，经酶切鉴定和序列测定表明所获得的cDNA克隆为该株病毒的特异性序列。     

登革4型病毒5′非编码区SLB元件对病毒复制和翻译的调控作用

目的探讨登革4型病毒5′非编码区SLB元件对病毒复制和翻译的调控作用。方法首先通过mfold3.2软件对登革4型病毒5′端RNA二级结构进行预测,确定了3个突变位点：SLB1,缺失位于短茎环82-87位5′UAR环化序列,并破坏其保守茎环结构;SLB2,在次环引入突变破坏其环状结构（M77G/C）;SLB3,突变仅涉及核苷酸,不破坏该次环二级结构（M77-78AG/GA）。然后在含有海肾荧光素酶（Renilla Luciferase,R·luc）报告基因的复制子（DEN-R·luc2A-RP）基础上,利用重叠PCR构建上述突变体。将突变体（包括相关的阳性和阴性对照复制子）分别线性化并体外转录成RNA后,取等量各转录体RNA,以脂质体法分别转染BHK-21细胞。通过间接免疫荧光（IFA）、RT-PCR、R.luc报告基因技术和实时定量RT-PCR对突变体的复制和翻译水平进行检测。结果SLB1突变体的翻译水平并未受到显著影响,但其复制水平出现显著下调。SLB2突变体的翻译水平亦未受到显著影响,但其复制水平受到完全抑制;SLB3突变体的复制和翻译水平均受到了完全抑制。结论登革4型病毒5′非编码区SLB元件对基因组RNA复制和翻译具有重要的调控作用。     

登革1型病毒广州06株基因组全长感染性克隆的构建与鉴定

目的:构建本室新分离的登革1型病毒广州06株基因组全长感染性cDNA克隆,为深入研究登革病毒致病机制奠定基础.方法:根据登革1型病毒广州06株基因组全序列中单一酶切位点设计特异引物,分别扩增并克隆5个病毒亚基因组cDNA片段,将其逐一拼接连入pWSK 29低拷贝质粒载体,获得病毒全长cDNA克隆,并将其体外转录为RNA,再转染细胞获得恢复病毒.进一步通过RT-PCR扩增病毒5′和3′非编码区序列和特异性间接免疫荧光对其恢复病毒进行鉴定.结果和结论:构建获得登革1型病毒广州06株基因组全长感染性cDNA克隆,其恢复病毒与野生型病毒具有相似的生物学特性.