乙型流行性感冒病毒的基因快速检测

〔目的〕建立乙型流行性感冒病毒的核酸快速诊断技术。〔方法〕采用RT -PCR方法对乙型流感病毒的HA基因进行检测 ,我们对乙型流感病毒的HA基因保守区域设计相关引物 ,进行扩增 ,并作了特异性与灵敏度比较。〔结果〕该引物只能扩增乙型流感病毒的特异性片段 ,而对其它型别的流感病毒以及麻疹、风疹、腮腺炎病毒无交叉反应。检测的灵敏度一次PCR可达 1TCID50 ,二次PCR反应可达 0 .1TCID50 。〔结论〕采用该方法从临床患者含漱液标本中的检出率 ,比采用MDCK细胞分离的阳性率更高 ,可达到迅速、正确地诊断乙型流感的实用目的。     

TaqMan荧光定量RT-PCR快速检测登革1、2型病毒

目的 建立特异、灵敏、快速的荧光定量RT—PCR方法用于检测登革1、2型病毒核酸，并初步应用于登革热的临床标本检测。方法 根据GenBank登录的登革热毒株序列。应用生物学软件进行序列比对，分别在登革病毒1型的NS5基因和2型的C基因的保守区设计特异性引物和TaqMan探针。对荧光定量RT—PCR反应条件进行优化，验证该方法的特异性、灵敏度和稳定性。同时对疑似登革热病例血清标本进行检测。结果 该方法对登革1、2型病毒的检测有高度的特异性，与登革病毒的4个血清型之间以及流行性乙型脑炎病毒、肾综合征出血热病毒等均无交叉反应，检测的灵敏度均达0．1TCID50，可从疑似登革热病例血清标本中直接检测登革病毒核酸，从病毒核酸提取至完成检测仅需3h左右。结论 本研究建立的TaqMan荧光定量RT—PCR是一种快速检测登革1、2型病毒特异、敏感的方法，适用于临床早期诊断。     

浙江省局部地区2002～2003年流行的无菌性脑膜脑炎的病原学检测与分析

浙江省局部地区 2 0 0 2～ 2 0 0 3年多次出现无菌性脑膜脑炎的流行。为对疫情进行病原学检测与分析 ,采集了临床标本 ,采用HEp 2、RD、Vero等细胞分离病毒 ,并用肠道病毒通用引物进行特异性逆转录 聚合酶链反应 (RT PCR)扩增。结果显示 :5 1份脑脊液标本中分离出埃可病毒 30型 (ECHO3 0 ) 5株 ,柯萨奇病毒B组 5型 (Coxsack ievirusB5,Cox B5) 1株 ;6 8份粪便标本中分离出ECHO3 0 34株 ,Cox B51株。RT PCR的结果与上述病毒分离结果相一致。此外 ,对采集的 1 5例患者的急性期、恢复期双份血清测定了特异性中和抗体 ,其中 1 3例患者抗体呈≥ 4倍增长。证实引起浙江省局部地区 2 0 0 2～ 2 0 0 3年无菌性脑膜脑炎的主要病原为ECHO3 0 。     

浙江首例人禽流感确诊病例流行病学调查

人禽流行性感冒（人禽流感）是由禽甲型流感病毒中某些亚型的毒株感染人而引起的急性呼吸道传染病，病死率高。1997年中国香港首次证实禽流感病毒（H5N1）感染人类以后，世界各地相继报道了多例禽流感病毒感染人并导致死亡事件，禽流感病毒已对人类健康构成严重威胁，引起了全世界的关注。我国大陆自2003年11月发生第一例人禽流感（H5N1）病例后，至2007年3月底，     

浙江省2000～2006年急性弛缓性麻痹病例实验室检测结果

为了巩固和加强浙江省的无脊髓灰质炎（脊灰）状态，继续保持高水平的口服脊灰减毒活疫苗（OPV）接种率和高质量的急性弛缓性麻痹（AFP）病例监测，进一步提高脊灰实验室的检测质量，及时监测可能出现的疫苗衍生脊灰病毒（VDPV）或输入性脊灰野病毒，以防止其在我省的扩散，现将浙江省2000-2006年AFP病例实验室检测结果报告如下。     

浙江省乙型流感病毒HA1基因分析

目的：了解浙江省近几年乙型流感病毒的基因变异情况和WHO推荐流感疫苗株对浙江省人体的保护情况。方法：采集浙江省类流感样本进行流感病毒的分离和鉴定，并对分离到的乙型流感病毒进行核酸的提取，采用逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR）扩增病毒基因后进行病毒血凝素HA1基因核苷酸序列测定，用DNAMAN和BioEdit生物软件对测序结果进行分析处理，并与WHO推荐疫苗株基因进行比对。结果：分离到Yamagata系和Victoria系两个进化系的乙型流感病毒，两系毒株均未发现核苷酸的丢失和插入，糖基化位点没有太大改变。毒株之间核苷酸的同源性为95.25%，氨基酸的同源性为95.28%。Yamagata系毒株HA1区域核苷酸序列长度为1038 bp，推导的氨基酸序列长度为346个，氨基酸变异替换数在6-8之间；Victoria系毒株HA1区域的核苷酸序列长度为1041 bp，推导的氨基酸序列长度为347个，氨基酸变异替换数在2-8之间，相比Yamagata系毒株在163位上都多1个天冬酰胺（N）。基因进化树上可见明显的Yamagata系和Victoria系两个分支。结论：浙江省人群交替流行着Yamagata系和Victoria系两个抗原性不同的进化系的乙型流感病毒，病毒的基因发生了变异，抗原已发生漂移。2001、2006两年WHO推荐乙型流感疫苗株与我省当年流行株为不同谱系毒株，预防保护效果不够理想，其余年份为同一谱系毒株，预防保护效果较好。     

浙江省近几年甲3亚型流行性感冒病毒神经氨酸酶基因分析

目的通过浙江省1998~2005年甲3亚型流行性感冒(流感)病毒的神经氨酸酶(NA)基因的序列比较,阐明近几年NA基因的变异与流感流行的关系。方法对浙江省1998~2005年流感流行期间分离的甲3亚型流感代表性毒株,采用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)扩增病毒NA基因,进行核苷酸序列测定,并用Bio-Edit软件作分析处理。结果浙江省近几年流感流行期间分离到甲3亚型流感病毒代表株13株,其NA基因核苷酸长度均为1 338bp,由此推导的氨基酸数为446个。1998~2005年甲3亚型流感病毒在NA基因区发生可遗传的氨基酸变异达22个,其中1998~1999年、1999~2002年变异最大,均达到9个氨基酸的差异;2003年后病毒的变异趋向平稳,这与NA基因系统进化树的结果相一致。此外,近几年来世界卫生组织推荐的甲3亚型流感疫苗株与当年的流感流行株之间存在一定的差异,而在2003年后的甲3亚型流感疫苗株与当年的流感流行株之间的符合程度较好。结论近年来浙江省甲3亚型流感病毒的NA区域与血凝素区域相似,均发生了较大的抗原性漂移,提示1999~2005年发生的2次流感流行是由于当年的甲3亚型流感分离株变异影响到病毒的抗原性所导致的。     

甲3型流行性感冒病毒环介导逆转录等温扩增检测方法的建立与应用

目的 建立适用甲3型流行性感冒(流感)病毒核酸检测的环介导逆转录等温扩增(RT-LAMP)方法,为基层实验室流感快速诊断服务.方法 对甲3型流感病毒设计两对环介导特异性引物与一个环引物,采用环介导RT-LAMP技术对甲3型流感病毒核酸进行等温扩增,并对反应体系进行优化.结果 采用RT-LAMP技术检测甲3型流感病毒核酸,敏感度可达0.01TCID50/反应,与荧光定量逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)的敏感度相一致,且对H1和H5亚型流感病毒、乙型流感病毒、呼吸道合胞病毒、麻疹病毒、风疹病毒、流行性腮腺炎病毒、副流感病毒与腺病毒无交叉反应,具有良好的特异性.采用该方法检测58份临床样本,病毒分离的阳性率为37.9%,而荧光定量RT-PCR与RT-LAMP的阳性率分别为53.45%和51.72%,敏感度明显高于通常的细胞病毒分离.结论 甲3型流感病毒环介导RT-LAMP检测方法,不仅快速特异、敏感性强,而且简便价廉,适于基层实验室使用.     

温州市瓯海区健康人群免疫针对性疾病免疫水平监测分析

目的了解温州市瓯海区常住和流动人群免疫针对性疾病免疫水平，评价免疫规划工作的成效，为制定免疫策略提供依据。方法采取分层整群随机抽样法，在3个调查点的常住和流动人群中随机调查〈1岁、1～2岁、3～4岁、5～6岁、7～14岁、15～19岁、≥20岁7个年龄组各15～20人，共719人。结果抗-HBs和HBsAg阳性率分别为68．71％、3．20％。麻疹H1抗体阳性率为87．90％，几何平均滴度（GMT）为1：9．007。白喉抗毒素阳性率为61．75％，几何平均浓度（GMC）为0．0627IU／ml。破伤风抗毒素阳性率为67．45％，GMC为0．7611IU／ml。百日咳凝集抗体保护率30．60％，GMT为1：67．04。乙脑IgG抗体阳性率为57．58％。甲肝IgG抗体阳性率为30．60％。结论麻疹抗体人群中和乙肝抗体在小年龄组人群中达到一定水平，已形成有效的免疫屏障。流动人群抗体水平普遍比常住人群低。另外白喉、百日咳、破伤风、乙脑、甲肝等人群抗体水平比较低，存在疾病流行的潜在危险。     

4种核酸提取方法在流行性感冒病毒核酸检测中的比较

目的：比较常见的4种核酸抽提方法，比较其对流行性感冒（流感）病毒检测的敏感性差异，为实验室应用和结果的评价提供依据。方法：对已确定效价的甲1型流感病毒，作10^-2～10^-5系列稀释，选用Roche公司Hish Pure Viral RNA Kit、QIAGEN公司的Rneasy mini Kit、国产Z生物公司RNA提取试剂盒和Invitrogen公司Trizol试剂等4种核酸提取方法提取上述标本核酸模板，采用罗氏公司的RT-PCR试剂盒，用实时荧光定量聚合酶链反应（FQ-PCR）对其进行评价。结果：在对不同病毒拷贝数流感病毒的检测中，4种核酸提取方法以Roche公司High Pure Viral RNA Kit提取效率最高，以此提取效率作为100％，则QIAGEN Rneasy mini Kit、Invitrogen Trizol和国产Z生物公司RNA提取试剂盒的平均提取效率依次为89．71％、75．30％、68．00％。经方差分析及t检验，4种方法之间存在显著性差异（P均〈0．05）。对临床标本的检测，也获得相似结果。结论：各试剂之间提取核酸的效率存在差异，应该选择性价比较好的方法进行临床标本的实验室RNA提取。