携带人胰岛素样生长因子-1重组腺病毒的构建和鉴定

[目的] 采用 Cre-LoxP同源重组系统构建并鉴定携带人胰岛素样生长因子-1( human insulin-like growth factor-1, hIGF-1)目的基因的复制缺陷重组腺病毒,为椎间盘退变的 hIGF-1基因治疗奠定基础.[方法] PCR合成 hIGF-1基因,用 pMD18-T载体克隆 hIGF-1目的基因,酶切、测序并进行 NCBI BLAST相似性在线分析.将 pMD18-T-hIGF-1和 pDNR-1r质粒分别行 EcoRⅠ和 BamHⅠ双酶切, DNA 连接酶连接双酶切产物,转化感受态大肠杆菌 DH5α,合成中间载体 pDNR-hIGF-1,酶切鉴定.Cre-loxP系统介导 pDNR-hIGF-1和 pInt.AV1.SpaT同源重组形成 pInt.AV1.SpaT-hIGF-1重组表达质粒,行 EcoRⅠ酶切鉴定.复苏 293细胞,将 pInt.AV1.SpaT-hIGF-1和 pInt.B.B质粒在 293细胞内进行同源重组成含 hIGF-1基因的复制缺陷重组腺病毒.倒置显微镜观察 293细胞病变样效应( cytopathogenic effect, CPE);透射电镜观察 293细胞中的病毒颗粒;提取细胞裂解液中病毒 DNA, PCR鉴定 hIGF-1目的基因的存在; Western blot 检测 hIGF-1蛋白表达.用半数组织培养感染量 (tissue culture infectious dose 50,TCID50)方法测定重组腺病毒的滴度.[结果]克隆的 hIGF-1目的基因经 NCBI BLAST相似性在线分析证实与 Homo sapiens IGF-1 (GI:19923111)完全相同.pInt.AV1.SpaT-hIGF-1酶切鉴定,出现 5.4 kb和 1 kb两条片段,与理论值完全相符.转染 293细胞 12～ 14 d后,大部分细胞出现肿胀,脱落等细胞病变样效应.PCR鉴定细胞裂解液中含有 hIGF-1目的基因.Western blot 证实重组腺病毒表达 hIGF-1蛋白.第 2代腺病毒的滴度为 80× 106 PFU/mL.[结论]成功构建出含有 hIGF-1目的基因的复制缺陷重组腺病毒.     

中药说明书功能与主治项表述形式刍议

中药说明书中功能与主治一项,是根据中医学的辨证施治理论来指导临床用药的概括描述,体现出中医学的辨证施治思想,反映出中医学与现代医学不同的科学体系,对同一疾病所认识的不同;反映出中医学与现代医学相结合的发展现状;还反映出中药学科自身的现代化发展水平。其在文字表述形式上的逻辑性、严谨性,反映出中药学这门学科本身的科学性。目前在中药说明书的功能与主治项的文字表述形式上并不统一。有些品种表述含混,只是罗列了     

齿接触半环抱槽式加压钢板固定肱骨骨折的生物力学原理

目的：按照生物力学原理,对传统的钢板加以改进,本文作者研制出一种新型内固定器械－齿接触半环抱槽式加压钢板（Ｃｏｍｐｒｅｓｓ ｓｔｅｅｌ ｐｌａｔｅ ｏｆ ｇｅａｒ ｃｏｎｔａｃｔ ｈａｌｆ ｃｙｃｌｅ ａｎｄ ｃｈａｎｎｅｌ ｔｙｐｅ ＧＣＣ）,对其力学性能进行生物力学测试,为临床应用提供依据。方法：采用９具新鲜成年湿润尸体肱骨标本,随机分为３组,原始骨（Ｎ）组、实验（ＧＣＣ）组,普通加压钢板（Ｇ     

Colles骨折两种外固定方法的对比研究

目的 对比小夹板外固定和石膏外固定治疗Colles骨折的差异。方法 从1996年1月至1999年10月,采用上述两种方法随机治疗Colles骨折50例。观察骨折骨性愈合后复位质量及疗效的优良率。结果 平均随访30.9月(8月～53月)。小夹板组:复位优2例,良1例,可2例,差20例。优良率为12％。疗效:优2例,良1例,可2例,差20例。优良率为12％。石膏组:复位优15例,良5例,可4例,差1例。优良率为80％。疗效:优16例,良5例,可3例,差1例。优良率为84％。差异具显著性。结论 与小夹板相比,石膏外固定是治疗Colles骨折的一种更好方法。     

hIGF-1基因转染促进退变椎间盘Ⅱ型胶原的表达

[目的]探讨人胰岛素样生长因子(human insulin-like growth factor-1,hIGF-1)基因在退变椎间盘中的表达及对椎间盘中Ⅱ型胶原表达的影响.[方法]参考文献[1]制备出腰椎间盘退变(intervertebral disk degeneration,IVDD)动物模型24只,随机分为携带hIGF-1基因重组腺病毒(Ad/CMV-hIGF-1)、hIGF-1生长因子及PBS组.L4、5、L5、6椎间盘中分别注射25 μl第2代Ad/CMV-hIGF-1 (8×108 PFU)、hIGF-1生长因子(100 μg/L)、PBS.注射后1、2、4、8周,Western blot检测hIGF-1蛋白表达;半定量RT-PCR检测Ⅱ型胶原mRNA的表达.[结果]hIGF-1蛋白带出现在7 540.00 u.Ad/CMV-hIGF-1组hIGF-1蛋白表达持续达4周以上,hIGF-1组表达持续约2周;PBS注射组无hIGF-1蛋白表达.Ⅱ型胶原电泳条带出现在200～300 bp;在注射后1～4周,Ad/CMV-hIGF-1组内Ⅱ型胶原mRNA相对表达量进行性增加,8周轻度下降,4个时期比较(F=12.18,P＜0.001);注射后1～8周,hIGF-1注射组、PBS注射组Ⅱ型胶原mRNA相对表达量进行性下降(F=27.38、21.56,P＜0.001).相同时间点3组比较,Ⅱ型胶原mRNA相对表达量Ad/CMV-hIGF-1组最高,PBS组最低(F=27.31～39.85,P＜0.001).[结论]hIGF-1基因在退变椎间盘中的表达能够促进合成Ⅱ型胶原.     

转染hIGF-1基因增强兔退变椎间盘蛋白多糖的表达

目的 探讨人胰岛素样生长因子(hlGF-1)基因在退变椎间盘中的表达及对椎间盘中蛋白多糖(agglecan)的影响.方法 制备新西兰大白兔腰椎间盘退变(IDD)模型24只,随机分为Ad/CMV.hlGF-1、hlGF.1生长因子及PBS组,每组8只.IA-5、L5-6椎间盘中分别注射第2代Ad/CMV-hlGF-1(8×108PFU)、hlGF-1生长因子(100μg/L)、PBS均25μL.注射后1、2.4和8周,Western blot检测hlGF-1蛋白表达;RT-PCR检测aggrecan mRNA的表达.结果 hlGF-1蛋白带出现在7.6×103ku.Ad/CMV-hlGF-1组hIGF-I蛋白表达持续达4周以上,hIGF-1组表达持续约2周;PBS注射组无hIGF-1蛋白表达.aggrecan电泳条带出现在200～300 bp;在注射后1～4周,Ad/CMV-hlGF-I组内aggrecan mRNA相对表达量进行性增加,8周轻度下降,4个时期总的比较(F=8.51,P<0.05),注射后1～8周,hlGF-1组、PBS组aggrecan mRNA相对表达量进行性下降.结论 hlGF-1能够增强椎间盘aggrecan的表达.     

腰椎间盘退变动物模型的建立

目的 制备椎问盘退变动物模型.方法 将48只新西兰大白兔随机分为骨性手术组和软组织手术组.骨性手术组L4L5、L5L6为实验组椎间盘,L3L4、L6L7为自身对照组;软组织手术组L4L5、L5L6为实验对照组椎问盘.术后1、2,4及8个月行MRI及分子生物学检查.结果 (1)MRI:兔髓核位于椎间盘中央,占椎间盘横截面积50%左右.术后1、2、4及8个月,3组椎间盘横断面T2高信号区域面积分数均逐渐减小(F=96.2～1544.4,P<0.01);术后相同时间段,实验组面积分数最小,自身对照组次之,实验对照组最高,差异有统计学意义(F=125.7～1850.6,P<0.01).(2)分子生物学:蛋白多糖、胶原为椎间盘主要细胞外基质,术后1、2、4及8个月,3组椎间盘蛋白多糖、Ⅱ型胶原表达量进行性下降(F=148.2～1544.4,P<0.01),Ⅰ型胶原表达量进行性上升(F=94.3～579.6,P<0.01).术后相同时间段,实验组蛋白多糖、Ⅱ型胶原最小,自身对照组次之,实验对照组最高(F=135.5～3520.6,P<0.01);Ⅰ型胶原表达量实验组高于实验对照组、自身对照组(F=7.8～143.1,P<0.01).结论 破坏关节突关节成功制备出椎间盘退变动物模型.     

胰岛素样生长因子-1基因在退变椎间盘中的表达及其对蛋白多糖、Ⅱ型胶原的影响

目的 观察人胰岛素样生长因子(hIGF)-1基因在退变椎间盘中的表达及对椎间盘蛋白多糖、Ⅱ型胶原的影响.方法 制备新西兰大白兔腰椎间盘退变(IVDD)模型24只,随机分为Ad/CMV-hIGF-1、hIGF-1生长因子及磷酸盐缓冲液(PBS)组,每组8只.L4～5、L5～6椎间盘中分别注射第2代Ad/CMV-hIGF-1(8×108PFU)、hIGF-1生长因子(100μg/L)、PBS 25 μl.注射后1、2、4、8周,Western blot检测椎间盘中hIGF-Ⅰ蛋白表达;半定量逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)检测蛋白多糖、Ⅱ型胶原mRNA的表达.结果 hIGF-1蛋白带出现在7.6×103道尔顿.Ad/CMV-hIGF-1组hIGF-1蛋白表达持续达4周以上,hIGF-1组表达持续约2周;PBS注射组无hIGF-1蛋白表达.ag-grecan电泳条带出现在200～300bp;在注射后1～4周,Ad/CMV-hIGF-1组内aggrecan mRNA相对表达量进行性增加,8周轻度下降,4个时期总的比较(F=8.51,P<0.05);注射后1～8周,hIGF-1注射组、PBS注射组aggrecan mRNA相对表达量进行性下降.三组中Ⅱ型胶原的相对表达量呈现aggrecan mRNA类似趋势.结论 hIGF-1基因能够在退变椎间盘中的表达;对椎间盘蛋白多糖、Ⅱ型胶原的影响存在时效依赖性.     

椎间失稳诱发椎间盘退变的超微结构改变

目的：观察新西兰大白兔腰椎关节突关节破坏致椎间盘退变的超微结构变化。方法：24只新西兰大白兔，随机分组骨性手术组（16只）和软组织手术组（8只）。骨性手术组完整切除L4、L5双侧下关节突，L4-5、L5-6为实验组椎间盘，L3-4、L6-7为自身对照组椎间盘。软组织手术组仅剥离L3至L7的椎旁肌肉，L4-5、L5-6为实验对照组椎间盘。术后1、2、4及8月行电子显微镜检查。结果：术后4月，各组椎间盘开始出现退变细胞，表现为外形不规则，细胞膜破裂，线粒体肿胀，核浓缩，核膜皱缩，异染色质较正常增加，核仁消失。退变细胞数量以实验组椎间盘最多。术后8月，实验组椎间盘开始出现大量死亡细胞，表现为溶酶体明显增多，细胞核扭曲，内质网扩张，线粒体空泡化。结论：关节突关节破坏能够诱发出椎间盘退变的超微结构改变。