胚胎和新生大鼠神经干细胞培养与分化的特性比较

目的:比较胚胎和新生大鼠神经干细胞的体外培养与诱导分化特性,为脊髓损伤、神经再生等疾病的治疗提供参考依据。方法:实验于2004-11/2005-05在安徽医科大学微生物学实验室完成。选取清洁级孕12d的SD大鼠和新生1d的SD大鼠各1只。①分别将胚胎鼠和新生鼠的大脑皮质体外分离培养,每3天换液1/2,每7d传代1次。②选取第3代神经干细胞克隆球吹打成单细胞悬液接种于预先涂有多聚赖氨酸的盖玻片的12孔培养板中,补足神经干细胞分化培养基,继续培养7d,进行神经干细胞的诱导分化。③通过形态学观察和Nestin免疫细胞化学鉴定,以及5-溴脱氧尿核苷法检测神经干细胞的增殖能力,并检测分化成熟的神经细胞标志抗原MAP2、胶质纤维酸性蛋白抗原的阳性细胞数及细胞总数。结果:①胚胎鼠与新生鼠原代、传代、分化培养的细胞形态学观察结果:胚胎鼠形成的神经球数量和每个神经球所含细胞数均多于新生鼠。胚胎鼠与新生鼠培养的球形克隆均可连续传代获得大量亚克隆细胞,并诱导分化成3种主要形态的神经细胞。②神经干细胞的鉴定结果:原代和传代的细胞均呈神经干细胞标志性蛋白-Nestin阳性反应,结合悬浮培养有神经球形成的现象,证明所观察细胞为神经干细胞。③胚胎鼠与新生鼠不同时间段单位面积Nestin与5-溴脱氧尿核苷阳性细胞数、细胞总数、阳性率的比较:两组培养1,3,7,11,14,28d后单位面积Nestin与5-溴脱氧尿核苷阳性细胞数、细胞总数及阳性率均有显著差异(t=2.41～92.71,P<0.01或0.05)。④胚胎鼠与新生鼠神经干细胞分化指标的测定:胚胎鼠及新生鼠的MAP2阳性细胞分别为(32.6±5.6)%,(30.7±6.7)%,抗原胶质纤维酸性蛋白阳性细胞分别为(47.5±9.4)%,(50.3±8.9)%,P均>0.05。结论:从胚胎鼠和新生鼠的大脑皮质均能够成功分离培养出神经干细胞,表达神经干细胞特异性标志蛋白Nestin,并具有自我更新及体外扩增传代能力。胚胎鼠神经干细胞数量多且增殖能力强,更适合用于神经再生与修复的临床治疗。     

2013年7月全国突发公共卫生事件及需关注的传染病风险评估

目的 评估2013年7月我国突发公共卫生事件及需要关注的传染病风险。 方法 根据全国突发公共卫生事件报告及重点传染病监测等各种监测资料和部门通报信息,采用专家会商法进行评估。 结果 随着暑期到来,预计7月全国突发公共卫生事件总报告事件数和病例数将有所下降。肠道传染病和虫媒传染病已进入流行季节;疟疾仍存在因输入导致局部暴发的可能;手足口病总体疫情呈现下降趋势,但报告病例数、重症数和死亡数仍将继续保持较高水平;食物中毒事件数仍维持较高的水平。中东呼吸综合征的疫情进展和国际应对情况仍需密切关注。此外,还应关注气象及自然灾害可能导致的次生公共卫生风险。 结论 预计2013年7月我国的突发公共卫生事件及传染病疫情发生态势与往年7月类似,需重点关注中东呼吸综合征及食物中毒事件。     

质粒介导的RNAi技术对截短HCMV IE2基因表达的抑制作用

目的 应用质粒介导的RNA干扰技术研究siRNA抑制截短HCMV IE2基因的表达的作用。方法 以pLL3．7质粒为模板，采用半套式PCR的方法扩增出含U6启动子的siRNA表达片段，连接pMD-T simple vector构建效应质粒表达重组体pMD-T-shRNARI和pMD-T-shRNAR2。同时采用RT-PCR方法从HCMV AD169株基因组中调取目的截短基因IE2，定向克隆到带有绿色荧光蛋白（GFP）作为报告基因的真核表达载体pEGFP-C1上，构建HCMVAD169株截短IE2基因重组表达质粒pEGFP-C1-IE2；用脂质体共转染效应质粒和靶基因表达重组体至Hep-2细胞中，荧光显微镜下观察效应质粒的RNA干涉作用，并观察RNA干扰的时效和量效改变。结果 三组质粒重组体构建成功，克隆到的2个shRNA表达载体对截短IE2基因的表达都有干涉作用。在与靶基因质粒量比为1：1和1：2时，其中pMD-T-shRNAR1 48～72h间干涉效应为100％，可完全封闭IE2的表达；pMD-T-shRNAR2使IE2处于极低水平表达，48～72h间干涉效应达到98．4％～99％。结论 通过质粒介导的RNAi技术能够有效地抑制HCMVIE2基因的表达，为治疗HCMV感染的药物开发提供了思路。     

人巨细胞病毒潜伏感染的研究进展

人巨细胞病毒(Human cytomegalovirus,HCMV)是疱疹类病毒科β亚科的DNA病毒.血清学调查表明60～100%成人有HCMV抗体,其流行无季节性倾向[1].虽然HCMV感染非常普遍,但绝大多数为潜伏感染.该种感染状态对健康个体并没有危害,而对于免疫功能低下的病人,如心脏或肾脏移植以及AIDS病人,病毒会形成严重危害,甚至为致死性的[2].因此HCMV潜伏感染的研究引起了广泛的关注.本文就HCMV潜伏感染的研究进行综述.     

高致病性禽流感病毒实验室检测方法研究进展

禽流感作为一种世界范围的禽类疫情,现已出现致病力高、宿主范围扩大(可感染哺乳类,甚至人类)的变异趋势,由此引发的公共卫生问题引起了国际社会的高度重视.及时、准确的检测已成为有效防控禽流感的前提.禽流感病毒的检测方法主要分为病毒分离培养、抗原检测、抗体检测及核酸检测四个主要方面,文章围绕这四个方面对禽流感病毒检测方法的研究进展进行简要综述.     

H5N1禽流感病毒HA假病毒的构建及特性研究

目的 构建包膜蛋白为H5N1禽流感病毒HA蛋白的假病毒,对其生物学特性进行研究,并将其初步应用于H5N1禽流感病毒的血清检测.方法 将我国分离的高致病性H5N1禽流感病毒的HA基因插入真核表达质粒,得到pLP-HA,与假病毒构建体系的三种质粒pLP1,pLF2和pEmGFP,瞬时共转染人胚肾细胞293T,48 h收集假病毒上清,对其感染性,血凝活性进行测定,并应用于微量中和实验.同时,构建了优化HA基因的假病毒以及一株含有越南禽流感病毒HA基因的假病毒,进行比较.结果 电镜下观察到假病毒颗粒的存在;Western-Blot表明HA蛋白存在于假病毒颗粒中;HA假病毒与野生型活病毒的微量中和实验相比,两者结果具有很好的相关性.结论 成功构建了不同高致病性H5N1禽流感病毒HA蛋白的假病毒,所构建的假病毒可以应用于微量中和实验.研究发现不同禽流感病毒株HA蛋白假病毒的包装效率不同,并且真核表达优化基因并不能显著提高假病毒颗粒包装效率.     

胚胎和新生大鼠神经干细胞培养与分化的特性比较

目的：比较胚胎和新生大鼠神经干细胞的体外培养与诱导分化特性，为脊髓损伤、神经再生等疾病的治疗提供参考依据。方法：实验于2004-11／2005-05在安徽医科大学微生物学实验室完成。选取清洁级孕12d的SD大鼠和新生1d的SD大鼠各1只。①分别将胚胎鼠和新生鼠的大脑皮质体外分离培养，每3天换液1／2，每7d传代1次。②选取第3代神经干细胞克隆球吹打成单细胞悬液接种于预先涂有多聚赖氨酸的盖玻片的12孔培养板中，补足神经干细胞分化培养基，继续培养7d，进行神经干细胞的诱导分化。③通过形态学观察和Nestin免疫细胞化学鉴定，以及5-溴脱氧尿核苷法检测神经干细胞的增殖能力，并检测分化成熟的神经细胞标志抗原MAP2、胶质纤维酸性蛋白抗原的阳性细胞数及细胞总数。结果：①胚胎鼠与新生鼠原代、传代、分化培养的细胞形态学观察结果：胚胎鼠形成的神经球数量和每个神经球所含细胞数均多于新生鼠。胚胎鼠与新生鼠培养的球形克隆均可连续传代获得大量亚克隆细胞，并诱导分化成3种主要形态的神经细胞。②神经干细胞的鉴定结果：原代和传代的细胞均呈神经干细胞标志性蛋白-Nestin阳性反应，结合悬浮培养有神经球形成的现象，证明所观察细胞为神经干细胞。③胚胎鼠与新生鼠不同时间段单位面积Nestin与5-溴脱氧尿核苷阳性细胞数、细胞总数，阳性率的比较：两组培养1，3，7，11，14，28d后单位面积Nestin与5-溴脱氧尿核苷阳性细胞数、细胞总数及阳性率均有显著差异（t=2．41～92．7l，P〈0．01或0．05）。④胚胎鼠与新生鼠神经干细胞分化指标的测定：胚胎鼠及新生鼠的MAB阳性细胞分别为（32．6&;#177;5．6）％，（30．7&;#177;6．7）％，抗原胶质纤维酸性蛋白阳性细胞分别为（47．5&;#177;9．4）％，（50．3&;#177;8．9）％，P均〉0．05。结论：从胚胎鼠和新生鼠的大脑皮质均能够成功分离培养出神经干细胞，表达神经干细胞特异性标志蛋白Nestin，并具有自我更新及体外扩增传代能力。胚胎鼠神经干细胞数量多且增殖能力强，更适合用于神经再生与修复的临床治疗。     

人巨细胞病毒增殖性感染新生乳鼠大脑皮质神经细胞

目的探讨人巨细胞病毒(HCMV)AD169株在体外增殖性感染新生乳鼠大脑皮质神经细胞。方法在长成单层的Balb/c新生乳鼠的大脑皮质神经细胞培养物上,接种TCID50为5×103/3ml的HCMVAD169株感染的HF细胞上清液。通过相差显微镜、PCR、RT-PCR、间接免疫荧光、TCID50、透射电镜等方法观察和鉴定HCMV在神经细胞内的感染状况。结果接种病毒的大脑皮质神经细胞在感染后第1天即可观察到特征性细胞病变效应,且随着感染时间的延长病变逐渐加重;HCMVIE和UL83DNA及mRNA检测均可见阳性条带;HCMVpp65蛋白免疫荧光检测亦为阳性,蛋白质表达量随着培养时间的延长明显提高;TCID50检测随着感染时间的延长病毒滴度逐渐上升;在神经元胞浆内通过透射电镜观察到病毒颗粒。结论HCMVAD169株可能具有增殖性感染乳鼠大脑皮质神经细胞的能力。