人CD28基因的分子克隆及其痘苗病毒载体介导的真核表达

用ＲＴ－ＰＣＲ方法从人Ｊｕｒｋａｔ细胞克隆了ＣＤ２８ｃＤＮＡ，将ＣＤ２８全编码区基因片段重组入ＰＵＣ质粒，测序证实所获得的为人ＣＤ２８基因。以痘苗病毒天坛株为载体，构建表达人ＣＤ２８的重组痘苗病毒株，并在重组病毒感染的细胞膜上表达人ＣＤ２８膜抗原，拟用该抗原免疫小鼠以制备抗ＣＤ２８的抗体。     

逆转录PCR克隆L－选择素cDNA

本文为从转录水平研究Ｌ─选择素表达的调节机制，利用Ｇｏｌｄｋｅｙ软件及ＥＭＢＬ数据库选出人与大鼠Ｌ─选择素高同源性但与其它细胞因子及其受体无高同源性的ｃＤＮＡ片段，设计ＰＣＲ引物，一步法分离Ｂ系Ｒａｊｉ细胞ＲＮＡ，逆转录ＰＣＲ扩增目的片段，ＨｉｎｆⅠ酶切初步确定后，将片段插入ＰＵＣ１９质粒ＨｉｎｃⅡ位点，转化ＪＭ１０９大肠杆菌，经测序证实扩增克隆片段与设计相符。     

外源基因在人造血干祖细胞中的转移和表达

应用逆转录病毒载体介导基因转移法将ｎｅｏ~ｒ基因导入人造血干祖细胞，并经体外液体长期培养。结果表明，产重祖病毒细胞ＰＡ３１７／Ｎ２的病毒滴度最高达６．５×１０~５ＣＦＵ／ｍｌ，用ＰＣＲ法从体外培养２、４、６ｗ及加入ｒＩＬ－１、ｒＩＬ－６的悬浮和贴壁的转染细胞中均可扩增出ｎｅｏ~ｒ基因ｃＤ－ＮＡ片段，非同位素化学发光法标记ｎｅｏ~ｒ探针与之杂交显示阳性结果。表明逆转录病毒介导目的基因已有效地转入体外培养的人造血干祖细胞中，并进行表达。     

逆转录病毒载体介导Neo~R基因转入正常人造血祖细胞

本文应用逆转录病毒载体介导基因转移法将含有新霉素抗性(neo~R)基因的双拷贝逆转录病毒载体pN2A转入正常人造血祖细胞。应用Ficoll分层液(比重1.064)富集人造血干、祖细胞,预培养后与已经照射的生产重组病毒包装细胞株共同培养24小时,经含G418(1000μg/ml)体外半固体培养,可见具有抗性的CFU-GM集落生长。应用PCR方法检测转染细胞中neo~R基因的转移和表达,在生产逆转录病毒的辅助细胞株PA317/N2及体外液体培养的骨髓细胞中均可扩增出neo~R基因的DNA片段,进一步证实了neo~R基因在正常人造血干、祖细胞的有效转移和表达。     

人CD28基因的分子克隆及其痘苗病毒载体介导的真…

用ＲＴ－ＰＣＲ方法从人Ｊｕｒｋａｔ细胞克隆了ＣＤ２８ ｃＤＮＡ，将ＣＤ２８全编码区基因片段重组入ＰＵＣ质粒，测序证实所获得的为人ＣＤ２８基因。以痘苗病毒天坛株国载体，构建表达人ＣＤ２８的重组痘苗病毒株，并在重组病毒感染的细胞膜上表达人ＣＤ２８膜抗原，拟用该抗原免疫小鼠以制备抗ＣＤ２８的抗体。     

重组人造血干细胞因子基因在人造血干／祖细胞的转移和表达

目的：拓展造血干细胞因子（ＳＣＦ）的研究和基因治疗途径。方法：利用基因重组技术，构建了编码可溶性人ＳＣＦ基因的逆转录病毒载体ｐＬＸＳＮ－ＳＣＦ，应用脂质体ｌｉｐｏｆｅｃｔｉｎ基因转移法将重组质粒导入Ψ２和ＰＡ３１７病毒包装细胞，经Ｇ４１８选择性培养基筛选，获得产重组病毒的包装细胞ＰＡ３１７／ＳＣＦ，其病毒效价为（２．４～８．５）×１０５ＣＦＵ／ｍｌ，继而感染人造血干／祖细胞。应用多聚酶链反应、ＡＰＡＡＰ免疫组化染色和化学发光－直接酶标法检测人ＳＣＦ基因在细胞中转移和表达。结果：逆转录病毒载体介导的ｒｈＳＣＦ基因在人造血干／祖细胞中获得有效转移和表达。结论：为进一步研究ＳＣＦ的生物学特性及开展干细胞移植等提供了一定的途径。     

人白细胞分化抗原CD28基因克隆及序列分析

ＣＤ２８分子是秀达于Ｔ淋巴细胞表面的大小约４４ｋＤ的双链同型二聚体多肽分子。ＣＤ２８可以通过共刺激的途径激活杀伤性Ｔ淋巴细胞，在肿瘤免疫中发挥重要作用，为了真核细胞表达ＣＤ２８分子并制备ＣＤ２８分子的单克隆抗体，以进一步研究ＣＤ２８分子在信号传递方面的功能，利用逆转录多聚酶链反应的方法，扩增了人ＣＤ２８分子的全序列基因，并将其克隆于ｐＵＣ１９质粒，进行了ＤＮＡ序列分析，为真核细胞表达ＣＤ２８分子并     

可溶性人干细胞因子基因导入真核细胞及其表达

本文构建了编码可溶性人ＳＣＦ基因的逆转录病毒载体ｐＬＸＳＮ－ＳＣＦ，应用Ｌｉｐｏｆｅｃｔｉｎ基因转移法将重组质粒导入Ψ２和ＰＡ３１７病毒包装细胞，经Ｇ４１８选择性培养基筛选，获得产重组病毒的包装细胞ＰＡ３１７－ＳＣＦ，其病毒效价为２．４×１０５～８．５×１０５ＣＦＵ／ｍｌ，继而感染人造血干祖细胞和ＮＩＨ３Ｔ３细胞。应用ＰＣＲ、ＡＰＡＡＰ免疫组化染色和化学发光一直接酶标法检测上述细胞中人ＳＣＦ基因的转染和表达，结果表明逆转录病毒载体介导转染的ｒｈ～ＳＣＦ基因在真核细胞中获得有效的表达。并将转有外源基因的人骨髓细胞进行体外液体长期培养（ＬＴＣ），观察造血干祖细胞增殖分化期间基因的表达情况。     

肿瘤脱落抗原

目前已经建立了一些肿瘤抗原单克隆抗体(McAb)制剂。这些肿瘤抗原包括:癌胚抗原(CEA),甲胎蛋白和人绒毛膜促性腺激素。经证实,单克隆抗体CEA测定法的敏感性可以与多克隆抗体相媲美,而其特异性明显高于多克隆抗体。目前已有人对用单克隆制剂鉴定新的肿瘤标志(CA19-9,CA125,MAM-6,DF3和B72.3)特性及临床意义进行了讨论。