重组人骨形态发生蛋白7腺病毒载体构建及在小鼠成肌细胞中的表达

目的：构建重组人骨形态发生蛋白7的腺病毒载体(AdBMP7)，并观察其在小鼠成肌细胞C2C12细胞中的表达情况。方法：实验于2004—05／10在北京大学医学部完成。RT-PCR方法从HKE293细胞中克隆出hBMP7 cDNA并亚克隆人穿梭质粒pAdtraekcmv中，构建pAdtrackcmv-hBMP7质粒。该质粒和腺病毒骨架质粒pAdEasy-1在BJ5183菌中进行同源重组后挑选阳性重组体pAd—hBMP7质粒。线性化pAd-hBMP7质粒转染293A细胞后检测病毒噬斑形成情况，并于转染后9d收获病毒，大量扩增并制备高纯度、高滴度的AdBMP7。将AdBMP7按MOI=100来感染C2C12细胞，48h后分别应用RT-PCR和免疫组化方法来检测hBMP7在mRNA和蛋白水平的表达。结果：成功克隆出hBMP7 cDNA，酶切鉴定pAdtraekcmv-hBMP7和pAd-hBMP7质粒正确重组，获得纯化后滴度达到5&;#215;10^12vp／mL的AdBMP7。AdBMP7能有效感染C2C12细胞并表达hBMP7蛋白。结论：应用AdEasy-1腺病毒载体系统可在短期内制备高滴度的携带GFP和hBMP7的重组腺病毒AdBMP7，并在为进一步研究BMP7基因治疗促进骨愈合打下基础。