损伤肝脏条件培养液体外诱导小鼠骨髓单个核细胞分化为肝细胞的研究

目的探索小鼠骨髓单个核细胞（BMMNCs）体外诱导分化为肝细胞的可行性及方法。方法将四氯化碳注射的小鼠肝脏进行培养，收集上清液，用于诱导BMMNCs分化。观察细胞分化中的形态变化；在1、7、14、21d时，逆转录聚合酶链反应（RT—PCR）和免疫荧光反应检测甲胎蛋白（AFP）、细胞角蛋白18（CK18）、CK19、肝细胞核因子3β（HNF3β）、酪胺酸胺基转移酶（TAT）和白蛋白（ALB）基因的表达，过碘酸Schiff氏剂反应（PAS）检测细胞糖原合成。结果诱导组细胞呈肝细胞样变化；RT—PCR检测，第7天可见AFP、CK19基因表达，第14天AFP表达增强，第21天减弱；第14天可见ALB、CK18、HNF3β基因表达，且持续到第21天；第21天TAT表达。免疫荧光反应结果显示，第21天ALB、CK18、CK19、AFP表达呈阳性；同时PAS糖原合成反应也出现阳性。结论BMMNCs在损伤肝脏条件培养液诱导下可跨越分化为肝细胞，该方法的建立对分化机制研究有重要意义。     

改良人骨髓间充质干细胞分离方法提高细胞定向分化能力

目的 改良人骨髓间充质干细胞(hBM-MSCs)分离方法,提高细胞定向分化能力.方法 用密度梯度离心法从少量人骨髓中分离得到单个核细胞,贴壁培养3天后换液,实验组换液后72h内每隔12h更换新鲜培养液,传代时胰蛋白酶37℃作用2min后终止消化;对照组未经频繁换液,胰蛋白酶消化3min.镜下观察分离细胞的形态变化.用成骨、脂肪和软骨细胞诱导液诱导两组第3代(P3)细胞分化,碱性磷酸酶钙钴染色法、茜素红染色法和Von Kossa银染色法检测成骨细胞分化;油红O染色法检测脂肪细胞分化;阿尔新蓝染色法检测软骨细胞分化.结果 首次换液72h后,实验组与对照组相比,贴壁细胞数量较少但形态均一性高.不同染色结果显示:诱导分化成骨细胞14天时,实验组95%以上细胞分化,对照组为60%～70%;诱导分化脂肪细胞21天时,实验组50%～60%细胞分化,对照组为40%;诱导分化软骨细胞21天时,实验组90%以上细胞分化,对照组为60%～70%.结论 首次换液72h内频繁更换新鲜培养液和传代时缩短胰蛋白酶消化时间的方法能够提高hBM-MSCs的定向分化能力.     

细胞因子诱导小鼠骨髓间充质干细胞跨越分化肝细胞的研究

目的 探索骨髓问充质干细胞(MSCs)体外跨越分化为肝细胞的诱导体系.方法 从单核细胞中分离间充质干细胞,用添加20 ng/ml HGF、10 ng/ml FGF-4、10 ng/ml OSM和10%NBS的IMDM培养液诱导间充质干细胞向肝细胞分化.结果 经细胞因子诱导的细胞出现肝细胞样变化,随诱导时间延长体积逐渐增大、形态往上皮样转变,胞浆丰富,出现双核或多核细胞.RT-PCR和免疫荧光检测结果显示,AFP在诱导初期表达,在诱导后期表达下降;CKl8、ALB和TAT的表达与诱导时间呈线性关系.第20天达到表达高峰;诱导20 d后免疫荧光检测,AFP、CKl8、ALB和TAT均为阳性;诱导20 d细胞的PAS糖原合成反应呈阳性,即具备糖原合成和储存的肝细胞特有功能.结论 HGF、FGF-4和OSM三种细胞因子组合,可诱导小鼠间充质干细胞向肝细胞分化,该结果为间充质干细胞跨越分化肝细胞的分子机制探讨和临床应用打下了基础.     

HGF和FGF4在诱导骨髓间充质干细胞向肝细胞分化中的作用

目的 评估肝细胞生长因子(HGF)和成纤维细胞生长因子4(FGF4)在诱导骨髓间充质干细胞向肝细胞分化中的作用.方法 CCl_4经腹腔注射复制小鼠肝损伤模型,48h后处死小鼠取肝组织,分离肝脏组织制备肝损伤条件培养液进行培养.以正常小鼠肝组织制备的培养液作为对照组.ELISA法测定培养0、1、5、3、6、12、24、48h后肝组织培养液中的HGF和FGF4含量.用肝损伤条件培养液培养骨髓间充质干细胞,分别加入HGF抗体和(或)FGF4抗体,以封闭培养液中的HGF和(或)FGF4因子,未添加细胞因子抗体的培养液作为对照组;ELISA法检测肝细胞特异性白蛋白(ALB)水平,免疫荧光法检测细胞内ALB、甲胎蛋白(AFP)、细胞角蛋白19(CK19)的表达,评价骨髓间充质干细胞向肝细胞的分化状况.结果 与对照组比较,肝损伤小鼠肝细胞培养液中HGF和FGF4表达量均升高(P<0.05);在培养3h时HGF、FGF4上升达峰值,随后下降;FGF4在培养12h达低谷后再次升高.抑制HGF和(或)FGF4第14天后,ELISA和荧光标记染色法检测均显示ALB表达下降,与对照组比较差异显著(P<0.05);荧光标记染色显示封闭后AFP及CK-19表达均有下降(P<0.05).结论 HGF、FGF4是诱导骨髓间充质干细胞向肝细胞分化的重要因子,且可能有其他因子参与诱导肝细胞的定向分化.     

损伤肝脏条件培养液体外诱导小鼠骨髓间充质干细胞分化为肝细胞

目的探索损伤肝脏条件培养液体外诱导小鼠骨髓间充质干细胞（MSCs）分化为肝细胞的可行性及方法。方法培养注射CCl4所致的损伤小鼠肝脏组织块,收集条件培养液,进行MSCs诱导分化。通过形态学观察、RT-PCR、免疫荧光反应和过碘酸Schiff反应鉴定分化细胞。结果诱导组细胞呈肝细胞样变化。RT-PCR检测显示：AFP基因第5天开始表达,第10天表达增强,此后表达减弱；细胞角蛋白18和Alb基因第10天开始表达,持续到第20天；第20天检测到酪氨酸氨基转移酶基因表达。免疫荧光反应显示诱导20 d的细胞AFP、细胞角蛋白18、Alb表达阳性,诱导20 d细胞过碘酸Schiff反应呈阳性。结论MSCs在损伤肝脏条件培养液诱导下可分化为肝细胞。     

三种细胞因子组合诱导小鼠骨髓单个核细胞跨越分化肝细胞的研究

目的探索诱导小鼠骨髓来源单个核细胞向肝细胞分化的诱导条件。方法首先通过密度梯度离心的方法获得小鼠骨髓来源单个核细胞,用添加20 ng/ml HGF、10 ng/ml FGF-4、10 ng/ml OSM和10%NBS的IMDM培养液诱导这些细胞向肝细胞分化。结果小鼠单个核细胞在三种细胞因子的诱导下,随诱导时间延长逐渐体积增大、形态上向上皮样转变,胞浆丰富,出现双核或多核细胞;半定量RT-PCR的结果显示,AFP和CK19的表达量在诱导初期首先增加,并且在诱导后期逐渐减少。而CK18、ALB和TAT的表达与诱导时间呈线性关系;免疫荧光检测诱导3周后的细胞,AFP、CK19、CK18和ALB均为阳性表达;诱导3周的细胞PAS糖原合成反应呈阳性,说明已经具备糖元合成和储存这一个肝细胞的特征性功能。结论组合HGF、FGF-4和OSM三种细胞因子可以诱导小鼠单个核细胞向肝细胞分化。     

三种细胞因子组合诱导小鼠骨髓单个核细胞分化为肝细胞

目的 探索小鼠骨髓来源的单个核细胞向肝细胞分化的诱导条件。方法 通过密度梯度离心的方法获得小鼠骨髓来源的单个核细胞；在含有100g／L新生牛血清的IMDM培养液中添加细胞因子HGF20 ng／ml、FGF-4 10 ng／ml和OSM 10 ng／ml，诱导骨髓来源的单个核细胞向肝细胞分化。结果 小鼠骨髓单个核细胞在3种细胞因子的诱导下，随着时间的延长，体积逐渐增大、形态上向上皮样细胞转变，胞浆丰富，出现双核或多核细胞；半定量RT-PCR的结果显示，甲胎蛋白（AFP）和细胞角蛋白19（CK19）的表达量在诱导初期首先增加，在诱导后期逐渐减少，而白蛋白（ALB）、细胞角蛋白18（CK18）以及酪胺酸胺基转移酶（TAT）的表达与诱导时间呈线性关系；免疫荧光检测诱导3周后的细胞，AFP、CK19、CK18和ALB均为阳性表达；诱导3周的细胞PAS糖原合成反应星阳性，说明已经具备糖元合成和储存这一肝细胞的特征性功能。结论 培养液中添加3种细胞因子（HGF、FGF-4和OSM）组合可以诱导小鼠单个核细胞向肝细胞分化。