辐射诱发大鼠气管上皮细胞转化相关基因的克隆

辐射诱发大鼠气管上皮细胞转化相关基因的克隆寿江李刚项晓琼胡迎春赵永良吴德昌（北京放射医学研究所，北京１００８５０）细胞生长，分化，凋亡及转化等过程，无一不受相关基因的调控；不同基因表达及基因不同时相的表达变化，是细胞表型变化的分子基础．辐射诱发细胞恶...     

辐射诱发BEP 2 D恶性转化中Smad 7对TGF-β/SMADs信号通路的调控

目的 研究BEP2D细胞经辐射诱发恶性转化过程中，作为SMAD蛋白家族的抑制分子，Smad7对TGF-β／SMAD介导信号通路的调控。方法 用Northem blot检测TGF-β刺激之后，永生化BEP2D细胞及辐射诱发恶性转化的BERP 35T2细胞中Smad7 mRNA的表达水平。人工合成SMAD结合元件(SBE)重复序列，同报告基因碱性磷酸酶融合。构建好的载体同Smad7真核表达载体共转染，TGF-β刺激，通过报告基因的表达丰度来检测Smad7对TGF-β／SMADs介导的信号通路的调控。结果 Northern杂交结果表明，永生化细胞Smad7基因对TGF-β刺激的应答正常，恶性化细胞的应答降低。基因转染的结果表明，永生化细胞中SBE的基础活性较恶性化细胞高；TGF—β刺激之后，永生化细胞中SBE活性显著增强，恶性化细胞变化不明显；同Smad7真核表达载体共转染之后，两种细胞中SBE活性均显著降低。结论 在辐射诱发细胞发生恶性转化过程中，Smad7基因对TGF-β信号通路的反馈调节作用发生紊乱，使TGF-β信号通路持续处于抑制状态，TGF-β对细胞的负性调控作用减弱，细胞进一步向恶性化发展。     

α粒子诱发转化人支气管上皮细胞系BEP2D中XRCC5等基因的突变检测

目的与方法:用聚合酶链式反应-单链构象多态性分析(PCR-SSCP)方法观察α粒子诱发人支气管上皮细胞系BEP2D细胞转化过程中相关基因的改变.结果:细胞转化过程中,双链断裂修复基因XRCC5发生碱基突变,改变从转化早期过程就持续存在;而p16基因exon2和hMSH2基因exon12未见变化.结论:XRCC5基因在α粒子照射后早期发生突变,使细胞丧失修复双链断裂损伤的能力,是α粒子诱发支气管上皮细胞转化过程中的启动事件之一.     

P53 GENE MUTATIONS IN NON-SMALL CELL LUNG CANCER DETECTED BY POLYMERASE CHAIN REACTION SINGLE-STRAND CONFORMATION POLYMORPHISM ANALYSIS

Mutations of the p53 tumor suppressor gone are the most frequent genetic akerations detected in human lung cancer. To assess the pathogenic significance of p53 gone alterations in Chlnege non-small cell lung cancer (NSCLC), 74 paired samples of primary lung cancer and normal lung tissue far away from the cancer were analyzed for mutations of the p53 gene(exons 5-8) using exon-specific PCR, single-gtrand conformation polymorphimax (PCR-SSCP). p53 mutations were observed in 55.4% (41/74) of the samples.No linkaiges were detected between the incidence of p53 mutations and histological type, lymph node metastasis, age or sex. Significant association between p53 mutations and degree of differentiation in edenotmremmnas, not in squamous cell carcinomas, was observed, The frequency of p53 mutations in(65. 3%) was higher than in nonsmokers (33. 3%) and reached stafisrical significance. We also found p53 mutations in 6/7 samples which had tissue invasion and distant metastasis. These results suggest that smcking could be an important factor in lung carcinogenesis, p53 mutation is a worse prognosis indicator in ade and nocarcinomas and related to high aggressive behavior of human lung cancer.     

辐射诱发细胞恶性转化时Smad7基因表达对细胞生长抑制效应的调节

背景细胞逃避转化生长因子-β(TGF-β)诱导的对细胞生长、增殖的抑制是许多肿瘤发生的一个重要机制.Smad7是TGF-β信号转导通路的抑制型Smads,它可阻断TGF-β信号在胞浆内的传导,其紊乱是TGF-β信号转导通路紊乱的机制之一.目的研究在辐射诱发细胞发生恶性转化过程中,Smad7过表达是否可通过抑制TGF-β信号转导通路来拮抗TGF-β对细胞的生长抑制效应.设计自身对照前瞻性研究.地点和对象研究在军事医学科学院放射医学研究所完成.实验对象为永生化人支气管上皮细胞BEP2D及辐射诱发恶性转化的人支气管上皮细胞BERP35T2.干预以外源性TGF-β1作为刺激因子,用Northem blot检测永生化BEP2D及辐射诱发恶性转化的BERP35T2细胞中Smad7基因的表达水平;用Smad7真核表达载体PCISmad7.neo稳定转染永生化及恶性化的人支气管上皮细胞系,筛选G418抗性克隆,用Western blot加以验证.用MTT法检测Smad7基因转染前后TGF-β对永生化及恶性化细胞的生长抑制效应.主要观察指标Smad7转染前后BEP2D及BERP35T2细胞Smad7表达水平及TGF-β1作用于Smad7转染前后细胞的增殖能力变化.结果辐射诱发恶性转化的BERP35T2细胞中Smad7表达水平高于永生化BEP2D细胞,相同浓度的TGF-β1对BERP35T2细胞的生长抑制效应较BEP2D细胞弱;BEP2D和BERP35T2细胞转染Smad7基因后,各筛选到2个稳定表达SMAD7蛋白的细胞克隆,同对照细胞比,TGF-β1对稳定表达Smad7基因的细胞生长抑制能力显著减弱.结论在辐射诱发细胞发生恶性转化过程中,Smad7基因表达增高,其过表达可降低TGF-β对细胞的生长抑制作用.     

辐射诱发细胞恶性转化时Smad7基因表达对细胞生长抑制效应的调节

背景：细胞逃避转化生长因子-β(TGF-β)诱导的对细胞生长、增殖的抑制是许多肿瘤发生的一个重要机制。Smad7是TGF-β信号转导通路的抑制型Smads，它可阻断TGF-β信号在胞浆内的传导，其紊乱是TGF-β信号转导通路紊乱的机制之一。目的：研究在辐射诱发细胞发生恶性转化过程中，Smad7过表达是否可通过抑制TGF-β信号转导通路来拮抗TGF-β对细胞的生长抑制效应。设计：自身对照前瞻性研究。地点和对象：研究在军事医学科学院放射医学研究所完成。实验对象为永生化人支气管上皮细胞BEP2D及辐射诱发恶性转化的人支气管上皮细胞。BERP35T2。干预：以外源性TGF-β作为刺激因子，用Northern blot检测永生化。BEP2D及辐射诱发恶性转化的BERP35T2细胞中Smad7基因的表达水平；用Smad7真核表达载体PCISmad7．neo稳定转染永生化及恶性化的人支气管上皮细胞系，筛选G418抗性克隆，用Western blot加以验证。用MTT法检测Smad7基因转染前后TGF-β对永生化及恶性化细胞的生长抑制效应。主要观察指标：Smad7转染前后BEP2D及BERP35T2细胞Smad7表达水平及TGF-β作用于Smad7转染前后细胞的增殖能力变化。结果：辐射诱发恶性转化的BERP35T2细胞中Smad7表达水平高于永生化BEP2D细胞，相同浓度的TGF-β对BERP35T2细胞的生长抑制效应较BEP2D细胞弱；BEP2D和BERP35T2细胞转染Smad7基因后，各筛选到2个稳定表达SMAD7蛋白的细胞克隆，同对照细胞比，TGF-β对稳定表达Smad7基因的细胞生长抑制能力显著减弱。结论：在辐射诱发细胞发生恶性转化过程中，Smad7基因表达增高，其过表达可降低TGF-β对细胞的生长抑制作用。     

ADPRT抑制剂对人肿瘤细胞的放射增敏效应

目的：从细胞的克隆形成能力和细胞ＤＮＡ双链断裂及修复几方面探讨了ＡＤＰ－核糖基转移酶（ＡＤＰＲＴ）的特异性抑制剂３－氨基苯甲酰胺（３－ＡＢ）对人卵巢癌细胞株ＨＯＣ８的放射增敏效应。结果表明，３－ＡＢ能降低受照细胞的克隆形成能力；照射所诱发的初始ＤＮＡ双链断裂水平不受３－ＡＢ的影响，但细胞对双链断裂的修复能力受到抑制，表现为慢速修复水平下降，两方面的结果呈正相关。结论：通过脉冲电场凝胶电泳测定ＤＮＡ双链断裂及其修复水平，可以预测细胞的放射敏感性。     

Annexin Ⅰ在α粒子转化细胞及肺癌组织中高表达

目的：探讨Ａｎｎｅｘｉｎ　Ⅰ表达与肺癌及细胞转化的关系。方法：Ｗｅｓｔｅｒｎ印迹、Ｎｏｒｔｈｅｒｎ印迹检测永生化 人支气管上皮 ＢＥＰ２Ｄ细胞及α粒子照射转化后 ＢＥＰ２Ｄ细胞中 Ａｎｎｅｘｎｉ　Ⅰ在 ｍＲＮＡ和蛋白质水平的表达,细胞免疫 化学检测 Ａｎｎｅｘｉｎ　Ⅰ在 ＢＥＰ２Ｄ细胞中的分布。Ｗｅｓｔｅｒｎ印迹检测肺癌病人正常组织与肿瘤组织中 Ａｎｎｅｘｉｎ　Ⅰ蛋白质的 表达。结果： Ａｎｎｅｘｉｎ　Ⅰ在α粒子照射转化后 ＢＥＰ２Ｄ细胞中 ｍＲＮＡ和蛋白质水平上的表达光密度均为永生化人支气 管上皮 ＢＥＰ２Ｄ细胞的 １.５倍; Ａｎｎｅｘｉｎ　Ⅰ在 ＢＥＰ２Ｄ细胞中分布于胞浆及细胞膜。本研究收集了 ８例肺鳞癌、４例肺腺 癌病人的肺肿瘤组织及正常组织,Ａｎｎｅｘｉｎ　Ⅰ在肺癌组织中的表达明显高于正常组织（Ｐ＜０.０１）,Ａｎｎｅｘｉｎ　Ⅰ在肿瘤 组织中表达的光密度与正常肺组织之比为 ２．７。结论： Ａｎｎｅｘｉｎ　Ⅰ在肺癌组织过表达,表明 Ａｎｎｅｘｉｎ　Ⅰ可能与肺癌及 细胞恶性转化的发生发展有关。永生化及α粒子照射恶转 ＢＥＰ２Ｄ细胞为进一步研究 Ａｎｎｅｘｉｎ　Ⅰ在恶性转化中的作 用提供了良好的模型。     

α粒子辐射诱导人肺鳞癌裸鼠转移模型的建立

目的 建立α粒子辐射诱导人肺鳞癌裸鼠转移模型。方法 α粒子辐射诱导人肺鳞癌细胞系BERP35T4原代接种裸鼠皮下，后采用组织块接种的方法，在鼠间连续传代3次．计算原代成瘤率及传代成活率，并观察肿瘤的转移情况，病理切片和免疫组织化学鉴定肿瘤的性质和来源．结果 (1)α粒子辐射诱导人肺鳞癌细胞系BERP35T4原代接种成瘤率为44．4％(4／9)；(2)原代肿瘤的体表转移率与肺转移率均为25％(1／4)；(3)病理切片鉴定为低分化鳞状上皮细胞癌；(4)免疫组织化学显示CK3和EMA表达阳性。结论 采用组织块接种的方法，在α粒子辐射诱导人肺鳞癌细胞系BERP35T4的基础上，经过裸鼠体内连续传代3次，成功地建立了人类肺癌裸鼠转移模型。     

多效生长因子基因沉默抑制PTEN基因敲除细胞的增殖

目的：在肿瘤抑制基因PTEN缺失的小鼠胚胎成纤维细胞Pten-/-MEF241细胞中,研究多效生长因子（pleiotrophin,Ptn）对细胞增殖的影响.方法：设计并合成可编码针对小鼠Ptn基因的小干扰RNA （siRNA）寡核苷酸,构建至pSilencerTM3.1-H1载体,将载体转染进Pten^-/-MEF241细胞中,获得稳定表达细胞克隆株,通过Northern印迹检测Ptn基因表达被抑制的情况,根据细胞生长曲线检测沉默Ptn基因对Pten^-/-MEF241细胞生长的影响.结果：获得的稳定克隆株中,与对照细胞相比,Ptn基因的表达在转染Ptn siRNA-B的3株细胞中均得到了有效的抑制,而在转染Ptn siRNA-C的2株细胞中抑制效果较差.生长曲线结果显示,在Pten^-/-MEF241细胞中,沉默Ptn基因能够减缓Pten^-/-MEF241细胞的生长速度.结论：本研究获得了可有效抑制Ptn基因的小干扰RNA,证明沉默Ptn基因可抑制PTEN 基因缺失细胞的增殖,提示Ptn可作为治疗具有PTEN基因突变的肿瘤的药物靶标.