实时荧光定量RT-PCR法建立版纳微型猪近交系中厚皮创面转化生长因子表达体系*◆

背景：版纳微型猪近交系能较好的模拟人取皮区创面,构建动物模型,检测与创面愈合及瘢痕形成密切相关的转化生长因子的表达。 目的：观察创面愈合过程中转化生长因子β1基因的表达情况。 方法：利用版纳微型猪近交系4~6月龄猪构建了皮肤创面愈合动物模型,通过提取皮肤创面总RNA,设计特异引物,对与创面愈合相关密切的转化生长因子β1基因进行了RT-PCR扩增。纯化目的片段并与pMD18-T载体连接,转化宿主菌DH5α,提取重组质粒DNA,并经酶切、PCR和测序鉴定,计算重组质粒原液拷贝数浓度并制备梯度浓度标准品,进行实时荧光定量PCR。 结果与结论：建立的转化生长因子β1基因mRNA表达实时荧光定量PCR检测方法特异性较好,检测灵敏度可达103 拷贝/µL,线性范围达103~109拷贝/µL,阈值循环数与PCR体系中起始模板量的对数值之间存在良好的线性关系(R2=0.988),扩增效率高(E=107.433%)。利用该检测体系检测了45份样品,效果良好,该方法可为研究TGF-β1基因在创面愈合过程中的作用机理奠定分子生物学基础。     

版纳微型猪近交系AQP3克隆、序列分析及组织表达

目的 克隆版纳微型猪近交系aquaporin 3(AQP3)基因,并利用生物信息学方法分析其序列特征,研究其在猪各组织中的表达情况.方法 从版纳微型猪近交系脾脏中提取总RNA,利用RT-PCR方法扩增猪AQP3编码区序列,将纯化的片段与pMD18-T载体连接,转化宿主菌DH 5α,筛选阳性克隆进行测序.并采用半定量RT-PCR方法分析版纳微型猪近交系不同组织中AQP3基因的表达情况.结果 成功克隆出AQP3基因编码区全长873 bp的序列,GenBank登录号为HQ888860,其编码290个氨基酸.氨基酸序列同源性分析表明,与牛的AQP3基因同源性最大,达99％.多组织半定量RT-PCR研究表明AQP3 mRNA在BMI猪的脾脏、肾脏、肺、小肠中均有表达,其中脾脏中表达最高.结论 成功克隆出了版纳微型猪近交系AQP3基因全长编码区,并对其编码的蛋白质功能进行了预测,为进一步的功能研究奠定了基础.     

版纳微型猪近交系133家系SLA-DQ cDNA的克隆和序列分析

目的 建立小鼠在体肿瘤多药耐药模型。方法 模拟临床以亚于治疗剂量的联合化疗PFC方案，诱导S180腹水型小鼠4周，流式细胞仪荧光检测P170、LRP、TOPOⅡ，建立能客观反应临床肿瘤多药耐药产生机制并适合中药干预肿瘤多药耐药研究的在体细胞模型。结果 化疗诱导后昆明小鼠S180腹水肿瘤细胞P170、LRP的表达率和ROPOⅡ活性明显提高，经传代后其表达稳定。结论 联合化疗诱导建立小鼠在体肿瘤多药耐药模型是可行的。     

超声引导下经皮激光消融在甲状腺良性结节治疗中的疗效评价

目的评价超声引导下经皮激光消融(percutaneous laser ablation,PLA)在治疗甲状腺良性结节(benign thyroid nodules,BTNs)中的有效性。方法检索有关PLA治疗BTNs相关文献,2位评价员按纳入及排除标准独立筛选、提取、评价文献质量,用软件Stata12.0行Meta分析。结果共纳入研究13篇,Meta分析显示PLA治疗后1个月TSH、T4、Tg较术前无统计学差异,TSH:SMD 95%CI:-0.01(-0.21~0.20);T4:SMD 95%CI:0.01(-0.19~0.22);Tg:SMD 95%CI:0.01(-0.07~0.38)。3个月后TSH变化无统计学差异,SMD 95%CI:0.21(-0.03~0.45);术后1、3、6、12个月结节体积缩小有统计学差异,1个月SMD95%CI:-0.52(-1.00~-0.04);3个月SMD 95%CI:-0.73(-1.16~-0.29);6个月SMD 95%CI:-0.90(-1.23~-0.58);12个月SMD 95%CI:-1.23(-1.75~-0.71)。结论 PLA不影响甲状腺重要血清生物学指标,明显缩小结节体积,并发症少,可望在临床中推广应用。     

版纳微型猪近交系TNF-α基因mRNA实时荧光定量PCR检测方法的建立

目的 快速、灵敏、可靠的检测与临床多种疾病密切相关的重要基因TNF-α的表达情况,构建TNF-α基因及内参GAPDH基因荧光定量PCR质粒标准品.方法 利用版纳微型猪近交系4～6月龄猪建立动物模型,提取皮肤创面总RNA,设计特异引物.进行RT-PCR扩增.纯化目的片段与pMD18-T载体连接,转化宿主菌DH5α,提取重组质粒DNA,并经酶切、PCR和测序鉴定,计算重组质粒原液拷贝数浓度并制备梯度浓度标准品,进行实时荧光定量PCR,生成标准曲线.结果 建立的TNF-α基因和GAPDH内参基因mRNA表达实时荧光定量PCR检测方法灵敏度分别可达10<''3>和10<''5>拷贝,线性范围分别为10<''3>～10<''9>和10<''5>～10<''9>拷贝,阈值循环数(Ct)与PCR体系中起始模板量的对数值之间存在的线性关系R<''2>分别为0.993和0.999,扩增效率E分别为111.073%和95.948%.结论 成功的构建了版纳微型猪近交系TNF-α基因质粒标准品和标准曲线,并用内参基因GAPDH进行校正,此方法可为探讨TNF-α基因在临床多种疾病中所发挥的分子机理奠定基础.     

石蜡包埋大肠癌肿瘤浸润淋巴细胞FCM单细胞悬液样本的制备

探讨石蜡标本中大肠癌肿瘤浸润淋巴细胞亚群单细胞悬液样本的制备方法。石蜡标本经切片、脱蜡、水化、消化、过滤、收集细胞等步骤制成单细胞悬液,滴加单克隆抗体,通过流式细胞仪检测,最后进行淋巴细胞亚群细胞分型获取及读数。     

腹主动脉瘤特异性ceRNA调控网络的筛选与构建

背景与目的 腹主动脉瘤（AAA）是一种在老年患者中发病率及病死率均较高的疾病。目前基于内源性竞争RNA（ceRNA）网络在AAA发病机制中的作用不明。本研究通过筛选和构建AAA特异性的长链非编码RNA（lncRNA）-微小RNA（miRNA）-mRNA的ceRNA网络,以期揭示ceRNA网络在AAA形成与发展中的作用。方法 首先通过基因表达数据库（GEO）筛选数据集,寻找AAA与正常腹主动脉组织的差异lncRNA及差异mRNA;利用Lasso回归从差异RNA中筛选疾病特征性基因;运用软件Starbase寻找与差异lncRNA和特异性mRNA共同结合的miRNA,利用Cytoscape软件构建lncRNA-miRNA-mRNA的ceRNA网络,使用Cytoscape中的cytohubba模块进一步筛选核心ceRNA网络。结果 筛选获得GSE7084和GSE57691两个数据集,获得差异mRNA 114个,差异lncRNA 13个;利用Lasso回归从差异mRNA中获得17个特异性的mRNA;结果显示,lncRNA HCP5-miR27-FOSB被认为可能是导致AAA发生发展最为关键的ceRNA网络。结论 所构建的ceRNA网络可能参与AAA的形成及发展,但该结果需开展后续研究进一步探明和验证。     

版纳微型猪近交系SRY基因编码区序列克隆及生物信息学分析

目的获得版纳微型猪近交系(BMI)SRY基因编码区序列并进行分子系统进化研究。方法以看家基因GAPDH为内参,对BMI猪的SRY基因编码区序列进行PCR扩增、克隆和序列分析,并应用Lasergene、Bi-oEdit、ClustalX、MEGA等生物信息学软件同鲸鱼、海豚、鹿、绵羊、牛、海豹、马、海象、熊猫、人、驴、熊、猫、虎和美洲豹等15个物种相应SRY编码区核苷酸序列和氨基酸序列进行了比对分析,在此基础上采用NJ和ME法对其编码区氨基酸序列构建了分子系统进化树。结果 BMI猪SRY基因编码区序列长711 bp,编码236个氨基酸,GenBank登录号为GU991615。BMI猪与鲸鱼、海豚、鹿、绵羊、牛、海豹、马、海象、熊猫、人、驴、熊、猫、虎和美洲豹的SRY基因编码区核苷酸序列相似性分别为83.7%、82.8%、78.4%、78.0%、76.9%、73.3%、73.1%、73.0%、72.9%、72.7%、72.7%、72.2%、71.6%、71.3%、70.8%,相应的氨基酸序列相似性分别为72.8%、54.5%、67.3%、64.5%、61.5%、61.9%、59.5%、61.4%、62.0%、59...     

版纳微型猪近交系GHR基因克隆及生物信息学分析

目的 获得版纳微型猪近交系（BMI）生长激素受体基因（GHR）序列,通过生物信息学分析预测GHR功能并进行GHR mRNA多组织表达谱分析。方法 以版纳微型猪近交系的肝脏组织为材料提取RNA,RT-PCR方法扩增GHR基因编码区序列,将序列连接至pMD18-T载体进行克隆、测序和生物信息学分析;半定量PCR检测GHR mRNA在BMI不同组织中表达量的差异。结果 克隆出了BMI GHR 编码区序列,提交GenBank获得登录号KC999114。该基因CDS长1917 bp,编码638个氨基酸。生物信息学分析表明,与长白猪的GHR序列相比BMI存在4处氨基酸替换,分别为p. E381D、p. A409S、p. L556V和p. A580G,均发生在胞内域。GHR基因多组织表达谱分析显示：GHR mRNA几乎在各组织中均有表达,在肌肉中表达量最高,在小肠、心、肝、神经纤维、脾、卵巢中表达量较高,在肺、胃、大脑、胰和肾中的表达量较低。结论 成功克隆了版纳微型猪近交系GHR全长编码区序列,进行了生物信息学功能分析和组织表达谱分析,为进一步阐明版纳微型猪近交系生长矮小机理奠定了基础。     

同时性双侧乳腺癌与异时性双侧乳腺癌预后差异的Meta分析

目的:系统评价同时性双侧乳腺癌(SBBC)与异时性双侧乳腺癌(ABBC)预后差异。方法:计算机检索国内外数据库,收集相关文献,经文献筛选、质量评价和资料提取后,对符合纳入标准的研究采用Revman 5.3软件进行Meta分析。结果:共纳入7个研究,共711例患者,其中SBBC患者225例,ABBC患者486例。Meta分析结果显示,SBBC患者组1、5、10年生存率均明显低于ABBC患者(OR=0.41,95%CI=0.22-0.77,P=0.005;OR=0.52,95%CI=0.39~0.69,P0.00001;OR=0.43,95%CI=0.25-0.74,P=0.003)。结论:在同等医疗条件下,SBBC的预后可能差于ABBC,但仍需作进一步的完整评估。