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登革Ⅱ型病毒E蛋白第三结构域在大肠杆菌中的表达、纯化及免疫反应性鉴定 总被引:1,自引:0,他引:1
目的 在大肠杆菌中表达登革Ⅱ型病毒包膜糖蛋白(E)的第三结构域(DⅢ),并进行纯化及免疫反应性鉴定.方法 登革Ⅱ型病毒接种乳鼠,提取总RNA,经RT-PCR扩增E蛋白全长基因片段,构建pMD 18-T-DV2-E载体.以pMD18-T-DV2-E质粒为模板,PCR扩增E蛋白DⅢ基因片段并纯化.用限制性内切酶双酶切纯化产物和表达质粒pET-32a(+)并连接构建重组质粒.筛选的阳性质粒转化至E.coli BL21(DE3)感受态细胞,IPTG诱导表达,表达蛋白经SDS-PAGE分析和Ni-NTA树脂纯化,Western blot鉴定.结果 RT-PCR扩增获得1.5 kb的E蛋白全长基因片段,构建pMD 18-T-DV2-E质粒;以pMD 18-T-DV2-E质粒为模板,PCR扩增获得320 bp的E蛋白DⅢ基因片段,构建pET-32a(+)-DV2-E-DⅢ表达质粒;IPTG诱导后经SDS-PAGE分析,表达相对分子质量约为29000的可溶性重组蛋白,其表达量占细菌裂解液中总蛋白量的52.50%:Western blot鉴定显示重组蛋白与His·Tag单抗和登革病毒(Ⅰ-Ⅳ)单抗均发生反应.结论 重组质粒pET-32a(+)-DV2-E-DⅢ在大肠杆菌中可溶性表达登革Ⅱ型病毒E蛋白第三结构域,重组蛋白能被登革病毒(Ⅰ-Ⅳ)单抗识别. 相似文献
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登革病毒是目前人类最重要的虫媒病毒之一,登革病毒包膜蛋白E的第三结构域是研究登革病毒亚单位疫苗及病毒入侵宿主细胞的重要靶点。 相似文献
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登革病毒是目前人类最重要的虫媒病毒之一,登革病毒包膜蛋白E的第三结构域是研究登革病毒亚单位疫苗及病毒入侵宿主细胞的重要靶点. 相似文献
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摘要:目的筛选白纹伊蚊C6/36细胞表达连接登革Ⅱ型病毒分子。方法提取C6/36细胞的总蛋白和膜蛋白,收集和纯化登革
Ⅱ型病毒,用12%SDS-PAGE分析C6/36细胞的总蛋白和膜蛋白,转于硝纤膜上,用病毒覆盖蛋白结合实验(VOPBA)筛选C6/36
细胞表达连接登革Ⅱ型病毒分子。结果C6/36细胞的总蛋白和膜蛋白经12% SDS-PAGE分离后转膜,分别与纯化的病毒液和
阴性对照液孵育,用抗登革病毒Ⅰ~Ⅳ单克隆抗体检测,结果显示病毒孵育组在67 000和30 000的位置有特异性的条带出现,而
阴性对照组无此条带。结论用VOPBA法初步从白纹伊蚊C6/36细胞中筛选67 000和30 000等登革Ⅱ型病毒结合分子,其功
能的鉴定正在进行。
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细胞表达连接登革Ⅱ型病毒分子。结果C6/36细胞的总蛋白和膜蛋白经12% SDS-PAGE分离后转膜,分别与纯化的病毒液和
阴性对照液孵育,用抗登革病毒Ⅰ~Ⅳ单克隆抗体检测,结果显示病毒孵育组在67 000和30 000的位置有特异性的条带出现,而
阴性对照组无此条带。结论用VOPBA法初步从白纹伊蚊C6/36细胞中筛选67 000和30 000等登革Ⅱ型病毒结合分子,其功
能的鉴定正在进行。
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