发现乙型肝炎病毒受体——肝细胞的钠离子-牛磺胆酸共转运蛋白

乙型肝炎(乙肝)病毒(HBV)属于嗜肝DNA病毒科正肝病毒属.HBV基因组为不完整的双链DNA,约3.2 kb;其包膜蛋白包括S、M及L蛋白,均为多次跨膜蛋白.S、M、L蛋白具有相同的C端,即为相同氨基酸序列的S区,但N端不同[1].丁型肝炎病毒(HDV)是HBV的卫星RNA病毒,具有HBV 的3种包膜蛋白,只有在与HBV共存时才能够包装为感染性颗粒及增殖.在研究HBV侵入细胞机制研究方面,HDV可以作为HBV的替代[2].全球目前有近3亿人感染HBV,并有约1500万人同时感染了HDV.     

狂犬病毒糖蛋白基因重组腺病毒与同一抗原核酸疫苗的联合免疫研究

目的 研究联合运用狂犬病毒糖蛋白基因重组腺病毒与同一抗原核酸疫苗对小鼠的免疫效果。方法 构建狂犬病毒糖蛋白（GP）的真核表达质粒pcDNA3.1/CVS-N2c GP作为核酸疫苗，瞬时转染COS－7细胞，间接免疫荧光试验检测pcDNA3.1/CVS-N2c GP的表达；以基因枪方法进行初次免疫接种和首次加强免疫，以表达同一抗原的复制缺陷型重组腺病毒通过鼻腔接种进行第二次加强免疫；ELISA试验检测血清狂犬病毒特异性IgG抗体，快速荧光灶抑制试验（RFFTT）检测狂犬病毒中和抗体。结果 间接免疫荧光试验表明pcDNA3.1/CVS-N2c GP能有效地表达GP于转染的细胞膜上，ELISA试验表明小鼠接受基因核核酸免疫后，仅诱导产生低水平的特异性抗体，而且重组腺病毒进行加强免疫后，特异性抗体水平显著提高。结论 联合运用狂犬病毒糖蛋白基因重组腺病毒与同种抗原核酸疫苗可克服它们单独使用时各自的缺点，能有效地诱导小鼠产生抗狂犬病毒特异免疫。     

单链抗体分子与链亲和素融合蛋白的制备

研究了抗人纤维蛋白单链抗体分子scFV-8E5与链亲和素融合蛋白的制备。链亲和素拼接在scFV-8E5 cDNA的3’端,制备的融合蛋白单体分子量约45kD。表达产物少数为周质间可溶型蛋白,多数为包涵体。无论是可溶型的蛋白产物或从包涵体中回收并复性的蛋白产物均有结合人纤维蛋白和生物素的功能。这个双特异性融合蛋白的成功制备证明了在scFV-8E5的3’端拼接其它效应分子的可行性。     

抗人纤维蛋白单链抗体-链亲和素融合蛋白的稳定性及对动物纤维蛋白的识别

目的：探索抗人纤维蛋白单链抗体链亲合素融合蛋白的应用前景。方法：构建抗人纤维蛋白单链抗体ｓｃＦｖ８Ｅ５基因与链亲和素基因的重组表达载体ｐＳＴＥ２８Ｅ５ ,表达的融合蛋白可特异性识别人纤维蛋白,同时有生物素的结合位点。转化ＪＭ１０９ 后用ＩＰＴＧ 诱导表达,ＥＬＩＳＡ 观察融合蛋白的稳定性。结果：抗人纤维蛋白单链抗体链亲合素融合蛋白稳定性好,可耐受至少２ ｗ ,４ ℃保存、数次反复冻融或一定时间的３７ ℃孵育。它能与大鼠和豚鼠的纤维蛋白结合,而与猪纤维蛋白反应不明显。结论：抗人纤维蛋白单链抗体链亲和素融合蛋白适用于大鼠或豚鼠血栓病模型,是临床前研究的有用材料。     

来自噬菌体抗体库识别KG1a细胞的scFv5C1的高效表达、纯化及其生物学特性

目的为深入研究源于噬菌体抗体库特定单链抗体（scFv）的功能和其识别抗原的分子特征,将识别KG1a细胞的单链抗体5C1scFv高效表达、纯化;用scFv测定未知抗原的相对分子质量（Mr）;并研究5C1scFv对KG1a部分细胞生物学特性的影响。方法基因重组构建表达5C1scFv的载体pSTE-5C1,在大肠杆菌中诱导表达,金属离子螯和亲和层析法纯化,获得高纯度的活性5C1scFv;借助生物素-链亲和素的高亲和力和高灵敏度的显色系统,用Westernblot分析其识别的KG1a细胞膜蛋白的Mr;用聚集实验分析5C1scFv对KG1a细胞同型聚集的影响。结果5C1scFv在大肠杆菌中获高效表达,纯化后活性蛋白产量可达每升培养物50～60mg,纯度大于95%;成功地测定了其识别抗原的Mr为（85.0/124.5）×103;并确认5C1scFv以浓度依赖方式抑制KG1a细胞的同型聚集。结论高效表达纯化的5C1scFv特异性识别Mr为（85.0/124.5）×103的KG1a细胞膜表面分子,此分子可能是一种在KG1a细胞表面表达的参与细胞同型聚集的分子或受体。这些结果为进一步深入研究抗原本质及克隆抗原分子基因奠定了良好的基础。     

KGla细胞免疫小鼠脾细胞scFv噬菌体展示文库的构建及其表达

用噬菌体展示技术构建ＫＧｌａ免疫小鼠的脾细胞ｓｃＦｖ表达文库。方法：用人髓系白血病细胞系ＫＧｌａ细胞免疫小鼠,取其脾细胞,ＲＴ－ＰＣＲ扩增ＶＨ和Ｖｋ基因并克隆入呼 体展示表达载体,构建ｓｃＦｖ文库,并测定文库的库容量和ＢｓｔＮ１酶切单个克隆分析文库的多样性。用ＫＧｌａ作为固相抗原,进行四轮吸附－洗脱－富集的筛选,ＳＤＳ－ＰＡＧＥ检验筛选后文库ｓｃＦｖ的呈示表达。结果：文库的库容为３＊１０＾６ｃｆｕ     

CD34分子特征及其表达调控

CD34分子是高度糖基化的Ⅰ型跨膜蛋白,选择性地表达于早期造血干/祖细胞、小血管内皮细胞和胚胎成纤维细胞表面。CD34在早期造血细胞膜上的表达随着细胞分化程度的增高而逐渐减弱,直至关闭,其基因表达受多层次的调控,是研究造血调控分子机制的一个理想的模型基因,深入研究CD34分子特征及其表达调控对推动造血调控、造血干/祖细胞相关理论和临床应用的研究进程具有重要意义。     

抗KGla细胞噬菌体展示ScFv的筛选及鉴定

目的 应用ＫＧ１ａ细胞（髓系白血病细胞系）筛选噬菌体抗体库,获得能以一定特异性结合ＫＧ１ａ细胞的单链抗体（ＳｃＦｖ）,克隆重其基因并研究其对应抗原在不同细胞表面的分布。方法 用完整的ＫＧ１ａ细胞筛选一个经ＫＧ１ａ细胞免疫小鼠脾细胞的ＳｃＦｖ噬菌体抗体库,重复筛选４轮;细胞ＥＬＩＳＡ鉴定了其中９６个克隆重与ＫＧ１ａ细胞的结合反应;从２６个ＫＧ１ａ细胞ＥＬＩＳＡ阳性克隆中挑选了３个克隆重,进一步用免疫