猪卵透明带-3β蛋白核心片断在E.coli中的表达

目的:探讨通过基因工程的方法在大肠杆菌中表达猪卵透明带蛋白pZP3b的核心片断。方法:采用PCR方法扩增原cDNA中编码第44-306个氨基酸的pZP3β核心片断的DNA序列,克隆入pET-3c载体进而在大肠杆菌E.coliBL21(DE3)pLysS中表达。结果:表达的pZP3β核心蛋白占菌体总蛋白的15%,并经Western-blot鉴定为目的蛋白。结论:pZP3β核心片断在大肠杆菌中获得较高的表达,有利于产物的纯化,为后续阐明pZP3β核心区域的性质和相关抗生育研究打下了基础。     

人端粒酶逆转录酶慢病毒载体的构建及人肝细胞的初步筛选

目的： 构建人端粒酶逆转录酶（hTERT）慢病毒表达载体,将其转染人肝细胞L02并且通过杀稻瘟筛选出阳性克隆细胞。方法：以PBABE-puro-hTERT质粒为模板PCR法获取目的基因attB1- hTERT-attB2,通过BP反应克隆至pDONR221;采用LR重组酶将pDONR221-hTERT和pLenti6/V5-DEST进行重组反应,形成pLenti6/V5-DEST- hTERT。将重组载体pLenti6/V5-DEST- hTERT与包装质粒充分混合,利用脂质体共转染293FT细胞,获得重组慢病毒颗粒。将其感染人肝细胞L02,通过杀稻瘟筛选获得阳性克隆。结果：测序发现入门载体pDONR221包含的目的基因hTERT 1547位点存在点突变(原碱基A变成G）,通过定点突变技术成功诱变并鉴定慢病毒表达载体pLenti6/V5-DEST- hTERT成功构建。重组慢病毒滴度为1×108 TU/L,获得20株稳定抗性的单克隆细胞。结论：成功构建人端粒酶逆转录酶的慢病毒表达载体,获得稳定抗性的单克隆肝细胞,为进一步建立永生化肝细胞系奠定了基础。     

核因子κB抑制蛋白家族的研究进展

核因子κB抑制蛋白(inhibitor ofNF-κB,IκB)是核因子κB(nuclear factor-kappa B,NF-κB)的抑制因子。IκB蛋白家族与Rel/NF-κB蛋白家族一样,也是一个大家族,它们都来源于相同祖先NF-κB/IκB超家族的Rel同源区-锚蛋白重复序列区(Rel homology domain-ankyrin repeat domain,RHD-ARD)结构[1]。IκB蛋白一方面可以在胞浆中与NF-κB二聚体结合形成复合物,抑制NF-κB进入细胞核发挥转录激活作用;另一方面也可以直接在细胞核内抑制NF-κB与DNA的结合。IκB蛋白家族的成员主要包括:IκBα、IκBβ、IκBε、Bcl-3、IκB…     

一种有效分离人尿激肽释放酶和人尿胰蛋白酶抑制剂的方法

人尿激肽释放酶和人尿胰蛋白酶抑制剂是存在于尿中的酸性蛋白.本文通过ZnCl2胶体沉淀和乙醇沉淀相结合的方法可有效分离两者,得率高、活性保留好.     

杆状病毒表达系统在疫苗研究中的应用

目前使用的体外基因表达系统有多种。各有其优缺点。常用的大肠杆菌原核表达系统操作方便，表达稳定。但表达基因的分子量有限，不能对表达产物进行翻译后修饰。动物细胞表达具有良好的翻译后修饰功能，但成本高，操作复杂。杆状病毒表达系统是近年来日益受到重视的又一个重要的表达系统。现介绍如下。     

重组人碱性成纤维细胞生长因子结构类似物在大肠杆菌中的高效稳定表达研究(英)

目的：用基因工程的方法获得高效稳定表达的重组人碱性成纤维细胞生长因子结构类似物。 方法： 利用定点突变技术，将天然hbFGF的第78与96位半胱氨酸替换为丝氨酸，通过载体pET-3c，突变基因被克隆并转化至大肠杆菌BL21(DE3)plysS，IPTG诱导表达后，SDS-PAGE分析蛋白表达结果。 结果： 纯化后突变蛋白的可溶性成分大幅度增加，而二聚体与多聚体显著减少至纯化后总蛋白的8％以下。MTT法的结果表明，结构类似物蛋白具有良好的生物学活性。这种新的结构类似物蛋白能较好地替代天然hbFGF在临床上的使用。 结论： 在不影响生物学活性的条件下，对个别氨基酸残基进行突变以获得新的结构类似物的方法，能够有效提高外源蛋白在大肠杆菌中表达的稳定性及可溶性。     

非全长型人卵透明带-3蛋白慢病毒表达载体的构建及其在中国仓鼠卵巢细胞中表达的研究

目的:构建含非全长型人卵透明带-3蛋白(hZP3)的慢病毒载体,转染293FT细胞获得重组慢病毒颗粒,感染中国仓鼠卵巢细胞(CHO)使其表达hZP3。方法:将hZP3基因序列插入到慢病毒系统的入门载体pENTR-11中构建为pENTR-hZP3,采用LR重组酶将pENTR-hZP3和pLenti6/V5-DEST进行重组反应,形成新重组载体pLenti6/V5-DEST-hZP3。将该重组载体和其它viruspower 3个质粒载体充分混合,用阳离子脂质体转染293FT细胞,培养和待细胞完全裂解后收集富含hZP3基因的病毒颗粒上清液,取适量上清液感染CHO-K1细胞,采用杀稻瘟Blastcidin筛选,挑单克隆对其扩增培养,进行基因水平和蛋白水平的鉴定。结果:获得的含hZP3基因的病毒颗粒上清液滴度为1×105TU/ml,随机挑取的16株单克隆细胞中,有9株表达hZP3。结论:成功构建含hZP3的慢病毒表达载体,获得表达hZP3的CHO株,为后续研究与开发奠定了基础。     

重组猪卵透明带-3β截短型蛋白的同源建模

目的:分析重组猪卵透明带-3β截短型蛋白(tunc-pZP3β)的结构,以及重组蛋白中产生强免疫原性的氨基酸序列的抗原表位。方法:利用生物信息学方法分析tunc-pZP3β的序列信息,并同源建模tunc—pZP3β的三维结构,分析抗原表位。结果:建立了tunc-pZP3β的模拟三维结构,显示出两段目的抗原表位氨基酸序列位于蛋白表面。结论:tunc-pZP3β从理论上保留着抗原表位。     

慢病毒介导hTERT基因对肝细胞生物学特性的影响

目的:研究慢病毒介导人端粒酶逆转录酶(hTERT)基因对人肝细胞L02生物学特性的影响。方法:将表达hTERT基因的重组慢病毒感染人肝细胞L02,通过杀稻瘟筛选获得阳性克隆。分别采用实时荧光RT-PCR和PCR-ELISA方法检测转染前后L02肝细胞的hTERT-mRNA水平和端粒酶活性的变化。通过MTT法、流式细胞术(FCM)及RT-PCR等方法观察其形态和生物学功能的变化。结果:转染后的L02肝细胞存在hTERT基因过表达和端粒酶活性上调,体外培养条件下维持肝细胞原有形态,存活期显著延长,增殖能力较强,同样具有表达和分泌ALB及糖原合成的功能。结论:外源性hTERT基因的异位表达不仅上调L02肝细胞的端粒酶活性,而且促进其增殖而不影响基本功能。     

人端粒酶反转录酶和绿色荧光蛋白融合基因慢病毒表达载体的构建

背景:外源性端粒酶反转录酶的表达可重建端粒酶活性,诱导细胞永生化.目的:采用慢病毒载体作为基因转移载体,克隆人端粒酶反转录酶的编码区全序列,同时选用绿色荧光蛋白作为目的基因表达标志物,构建人端粒酶反转录酶慢病毒表达载体.设计、时间及地点:开放性实验,单一样本观察,于2007-06/2008-03在暨南大学生物工程研究所及暨南大学附属第一医院中心实验室完成.材料:pBABE-puro-hTERT质粒由Robert Weinberg教授惠赠,质粒pDONR221,pLenti6N5一DEST,ccdB Survival,Stb13及293FT细胞由暨南大学生物工稃研究所提供.方法:以pBABE-puro-hTERT质粒为模板聚合酶链反应法获取目的基因人端粒酶反转录酶(包含酶切位点BglⅡ、HindⅢ),通过BP反应克隆至pDONR221,以质粒pEGFP-N1为模板,以聚合酶链反应法获取目的基因增强型绿色荧光蛋白(包含酶切位点Hind Ⅲ,Bg Ⅲ),通过酶切及连接反应形成pDONR221一hTERT-EGFP.采用LR重组酶将pDONR221-hTERT-EGFP和pLenti6/V5-DEST进行重组反应,形成pLenti6/V5一DEST-hTERT-EGFP.将PLenti6N5一DEST-hTERT-EGFP与包装质粒混合,利用脂质体共转染293FT细胞.主要观察指标:通过酶切、聚合酶链式反应及测序验证重组质粒pDONR221-hTERT-EGFP和pLenti6N5-DEST-hTERT-EGFP是否构建成功.包装重组慢病毒,应用荧光显微镜观察报告基因绿色荧光蛋白在293FT细胞中的表达情况.结果:测序发现慢病毒入门载体pDONR221包含目的基因hTERT 1547位点存在点突变(原碱基A变成G),通过定点突变技术成功诱变并鉴定慢病毒表达载体pLenti6N5-DEST-hTERT-EGFP成功构建.转染后的293FT细胞在荧光显微镜下观察可见强绿色荧光.结论:实验成功构建了人端粒酶反转录酶和绿色荧光蛋白融合基因的慢病毒表达载体,为人端粒酶反转录酶稳定转染提供快速、简洁的方法.