HaloTag 技术在α-突触核蛋白质的细胞影像与定量分析中的应用

目的：探讨 HaloTag 技术用于α-突触核蛋白质（α-synuclein,SNCA）在细胞内荧光成像及半定量分析的方法及其应用。方法采用重组克隆技术构建 pHalo-SNCA 质粒,将其转染至 HEK293人胚肾细胞中,经 Western blotting 鉴定 Halo-SNCA 融合蛋白质的表达;通过激光共聚焦显微镜观察 Halo-SNCA 在细胞内的定位与分布;通过蛋白酶催化的解偶联反应的荧光强度测定细胞内 Halo-SNCA 的荧光强度进行目的蛋白质的间接定量分析。结果本研究成功构建了 Halo-SNCA 真核表达质粒,能够在转染的真核细胞中高效表达目的融合蛋白质,该融合蛋白质结合特定的荧光配基后,可通过激光共聚焦显微成像分析 Halo-SNCA 在细胞中的动态水平与分布状况。此外,经水解释放的荧光配基可用于表达融合蛋白质在细胞中较为精确的相对定量分析。结论HaloTag 技术能够用于 SNCA 在细胞内成像和定量分析,同时可以作为细胞生物学和生物化学分析的可关联检测指标。对于SNCA 的生理功能以及在神经系统病变中的作用等相关研究,HaloTag 具有令人瞩目的潜在应用前景。     

TH 1/TH 2、TH 17/Treg轴失衡在儿童神经母细胞瘤进展中的作用

目的探讨外周血辅助性T细胞(T helper cell,T_Hcell)亚群在儿童神经母细胞瘤(Neuroblastoma,NB)患儿初诊时的表达及T_H1/T_H2、T_H17/Treg轴失衡的临床意义。方法选取2015年5月至2017年6月于首都医科大学附属北京儿童医院确诊的NB患儿以及健康儿童为研究对象,流式细胞术检测NB患儿初诊时及健康儿童体检时外周血标本中T_H1细胞、T_H2细胞、T_H17细胞、Treg细胞的比例,并用非参数检验进行统计学分析。结果 NB组患儿的外周血CD4+T细胞中T_H1细胞[8.20(4.90,13.80) vs 13.05(9.83,17.80),Z=-5.40,P0.05]和T_H17细胞[0.30(0.20,0.60) vs 0.78±0.56,Z=-4.11,P0.05]的比例较健康儿童明显下降,T_H2细胞[0.70(0.40,1.10) vs 0.50(0.30,0.88),Z=-2.49,P0.05]和Treg细胞[6.75(5.60,8.70) vs 5.24±1.92,Z=-3.70,P0.05]的比例较健康儿童明显升高。NB患儿主要临床症状,如危险度,肿瘤原发部位,受累部位等不影响T_H细胞亚群比例的变化(P0.05)。结论 NB患儿外周血中辅助性T细胞亚群比例较健康儿童出现明显轴失衡情况; NB患儿在诊断初期的主要临床症状不影响T_H细胞亚群的比例变化。     

应用流式细胞术辅助诊断神经母细胞瘤患儿骨髓侵犯

目的应用CD45/CD56/CD81/GD2四色组合方案的流式细胞术诊断神经母细胞瘤(NB)患儿骨髓侵犯,并评估其准确性。方法连续纳入2019年6月至2020年6月首都医科大学附属北京儿童医院肿瘤内科收治且确诊为NB患儿120例,诊断初期行骨髓细胞形态学(包括骨髓涂片和骨髓活检免疫组化)检测。应用CD45/CD56/CD81/GD2四色组合方案的流式细胞术对采集的NB患儿骨髓标本进行检测分析,并与细胞形态学结果进行比较。采用SPSS 13.0统计学软件进行数据处理,一致性分析采用Kappa检验。结果在37例骨髓细胞形态学阳性NB患儿组中,流式细胞术结果阳性34例,准确率为91.8%;83例骨髓细胞形态学阴性患儿组中,流式细胞术结果阴性82例,准确率为98.7%。流式细胞术与骨髓细胞形态学结果具有较强的一致性(Kappa=0.921,P0.001)。结论应用CD45/CD56/CD81/GD2四色组合方案的流式细胞术能够快速、准确诊断NB患儿骨髓侵犯,并可弥补骨髓细胞学检查的不足。     

聚二甲基硅氧烷定制微培养装置及其在肿瘤细胞迁移浸润动态分析中的应用

目的利用新型有机硅材料聚二甲基硅氧烷(polydimethylsiloxane,PDMS)构建细胞组织微培养装置,建立肿瘤迁移浸润的动态分析方法,对迁移的细胞进行形态学和生物学检测。方法设计并用PDMS定制具有独立分割功能的细胞微培养装置。在人脑胶质瘤U87MG细胞中检测时间依赖的迁移行为和细胞迁移信号转化生长因子-β(transforming growth factor-beta,TGF-β)驱动的荧光素酶活性。检测肿瘤细胞在缺氧环境下迁移行为的改变,并与经典的Trans Well细胞迁移检测结果进行了对比。结果应用定制PDMS培养装置能够动态观测细胞迁移浸润,通过对迁移细胞群的分离回收的细胞和相关信号通路的快速定量分析能够更加全面准确地反映细胞迁移的动态表型改变和参与机制。结论应用PDMS定制细胞微培养装置进行细胞动态描述和分析,对研究肿瘤细胞迁移过程及其机制是一个可行且极具潜力的新方法。本微培养装置的特色在于在肿瘤细胞迁移过程中同时完成对形态学和分子生物学的分析并进行相关性研究。     

免疫抑制治疗对儿童重型再生障碍性贫血 细胞因子表达的影响

目的 探讨重型再生障碍性贫血(AA)患儿经免疫抑制治疗（IST）后外周血相关细胞因子表达水平的变化。方法 纳入2017年10月至2018年12月在首都医科大学附属北京儿童医院（我院）住院初诊为获得性重型AA（SAA）/极重型AA（VSAA）且应用IST治疗的患儿为SAA/VSAA组，同期在我院住院初诊为获得性非重型AA（MAA）并给予环孢素A(CsA)口服治疗的患儿为MAA组。采用流式细胞术检测两组患儿初诊时、SAA/VSAA组治疗6个月和12个月、MAA组治疗6个月外周血中IFN-γ、TNF-α、IL-2、IL-4、IL-6和IL-10的表达水平。结果 SAA/VSAA组25例，MAA组37例。①初诊时SAA/VSAA组IFN-γ和IL-6表达较MAA组增加（P<0.05）。②SAA/VSAA组经IST治疗1年后，IFN-γ和IL-6较治疗前明显降低，差异均有统计学意义(P<0.05)。③截至末次随访，SAA/VSAA组除3例失访外，余22例全部生存，无复发。结论 SAA/VSAA患儿血清细胞因子水平异常，IST可显著改善初治患儿相关造血负向调控因子的表达。     

重型再生障碍性贫血患儿免疫抑制治疗疗效及T细胞亚群变化的临床分析

目的探讨免疫抑制治疗(IST)应用于儿童获得性重型再生障碍性贫血(SAA)/极重型再生障碍性贫血(VSAA)的疗效及对其T细胞亚群的影响。方法选择2017年7月至2019年9月, 北京儿童医院血液病中心收治的采取IST的35例SAA和15例VSAA患儿为研究对象。其中, 男性患儿为33例, 女性为17例, 中位年龄为9岁(2～14岁)。对患儿均采取抗胸腺细胞球蛋白(ATG)联合环孢素的IST。回顾性收集患儿接受IST后的疗效, 以及IST前, 治疗后3、6、12个月时流式细胞术(FCM)检测的T细胞亚群比例。对SAA与VSAA患儿T细胞亚群比例比较, 采用t检验或者Wilcoxon秩和检验, 达完全缓解(CR)、部分缓解(PR)与未缓解患儿T细胞亚群比例比较, 采用完全随机设计资料的方差分析或者Kruskal-WallisH检验;达CR患儿IST前与治疗后12个月时T细胞亚群比例比较, 采用配对t检验或者Wilcoxon符号秩和检验。对血液学缓解与未缓解患儿IST前、治疗后3、6、12个月时调节性T细胞(Treg)比例比较, 采用重复测量资料的方差分析。对血液学缓解患儿IST前、治疗后...     

MYCN和PHOX2B基因联合血浆游离DNA检测在高危神经母细胞瘤危险度分层及预后评估中的作用北大核心CSCD

目的探讨MYCN基因、PHOX2B基因及血浆游离DNA(cfDNA)水平用于高危神经母细胞瘤(NB)危险度分层及预后评估的作用和意义。方法对2017年8月至2018年12月首都医科大学附属北京儿童医院收治的94例高危NB患儿进行前瞻性研究,分别于初诊时、化疗4个疗程和6个疗程后检测MYCN基因、PHOX2B基因及cfDNA水平,观察治疗过程中3项指标的变化,采用χ^(2)检验和Kaplan-Meier生存分析法评价其与疗效的关系。结果94例患儿中MYCN基因扩增14例(14.9%),PHOX2B基因阳性76例(80.8%),cfDNA水平>100μg/L者56例(59.6%)。MYCN基因扩增患儿初诊高乳酸脱氢酶(LDH,≥1500 U/L)比例(6/14例)显著高于基因正常组患儿(9/80例)(P=0.009);PHOX2B基因阳性患儿多部位转移病例(54/76例)及高神经元特异性烯醇化酶(NSE,≥370μg/L)比例(37/76例)显著高于基因阴性组患儿(5/14例,2/14例)(P=0.015、0.020);cfDNA高水平患儿初诊高LDH及高NSE比例(13/37例,28/37例)显著高于cfDNA低水平组患儿(2/48例,10/48例)(均P<0.001)。治疗过程中,随着肿瘤负荷减小,PHOX2B基因拷贝数和cfDNA水平较初诊时显著降低[0(0~719.6)拷贝比1723.5(0~186000.0)拷贝;19.0(1.1~225.5)μg/L比200.6(8.0~5247.4)μg/L](均P<0.001)。初诊时,MYCN基因扩增组患儿2年无事件生存(EFS)率显著低于MYCN基因正常组患儿[(33.3±13.1)%比(58.5±7.1)%,P=0.020];PHOX2B基因阳性组患儿2年EFS率显著低于阴性组患儿[(47.9±7.1)%比(79.1±11.1)%,P=0.043];cfDNA高水平组(≥229.6μg/L)2年EFS率显著低于cfDNA低水平组[(38.6±9.8)%比(71.7±8.2)%,P=0.001]。6个疗程后PHOX2B基因阳性组患儿2年EFS率显著低于基因阴性组患儿[(16.7±14.4)%比(60.6±6.6)%,P=0.014];维持治疗前间碘苄胍(MIBG)核素扫描阳性组患儿2年EFS率显著低于阴性组患儿[(35.2±11.7)%比(65.8±7.1)%,P=0.037]。治疗过程中,MYCN基因和cfDNA水平与患儿预后无显著相关性。将6个疗程后的PHOX2B基因及维持治疗前MIBG结果联合分组进行生存分析(PHOX2B+/MIBG+,PHOX2B+或MIBG+,PHOX2B-/MIBG-),组间比较差异有统计学意义[0比(53.6±1.2)%比(65.5±7.4)%,P=0.003]。结论MYCN和PHOX2B基因及cfDNA水平在高危NB危险度分层及预后评估中具有重要作用;与MYCN和cfDNA水平相比,PHOX2B基因更适于治疗过程中的疗效监测,PHOX2B与维持治疗前的MIBG结果联合分析,用于判断患儿治疗效果,评估体内残余病灶更精准。