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目的:利用重组逆转录病毒载体pLNCX2-pENK,研究pENK基因在NIH3T3细胞中是否能够稳定表达.方法:用pLNCX2-pENK转染病毒包装细胞PT67,其病毒上清液感染NIH3T3细胞,检测pENK基因是否整合人NIH3T3细胞基因组中并通过RT-PCR及放射免疫法检测基因表达情况.结果:病毒基因组整合到NIH3T3细胞基因组中,并检测到目的基因转录及蛋白表达.结论:用逆转录病毒载体能将pENK基因整合到靶细胞NIH3T3基因组中,且该基因能长期稳定表达,为慢性疼痛的进一步治疗奠定了基础. 相似文献
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目的:精子膜蛋白PH-20分布在精子表面,在受精过程中起重要作用,可作为免疫避孕候选疫苗.采用脂质体介导基因转染法将pcDNA3.1( )-hPH20DNA疫苗质粒导入小鼠骨骼肌中,检测目的基因hPH-20在体内的表达水平.方法:实验于2006-06/2007-02在郑州大学解剖学实验室完成.①清洁级健康BALB/C小鼠12只,随机数字表法分为重组质粒组、空载体组、生理盐水组,4只,组,实验过程中对动物的处置符合动物伦理学标准.已构建好的pcDNA3.1( )-hPH20重组质粒由本室保存.②实验方法:质粒提取后,用精胺盐酸去除内毒素,鲎试剂榆测晕阳性代表去除成功.取少量质粒行琼脂糖电泳鉴定纯度,用紫外分光光度计测量质粒DNA的含量.每只小鼠于股四头肌分点注射利多卡因预处理3 d.重组质粒组将脂质体包裹的peDNA3.1( )-hPH20 DNA缓慢注射于股四头肌内,200μg/只.空载体组单纯将pcDNA3.1( )缓慢注射到股四头肌内,200 μ g/只.生理盐水组于相同部位缓慢注射等鼍生理盐水.重组质粒组分别于注射后第4,7,11,16天以断颈法各处死1只小鼠,空载体组、生理盐水组小鼠均于注射后第11天同法处死.迅速取股内侧肌肉30mg,研磨成粉末状,RT-PCR法检测目的基因hPH-20 mRNA在体内的表达.结果:①提取质粒琼脂糖凝胶电泳检测结果:提取的质粒成功去除内毒素后,琼脂糖凝胶电泳显示质粒纯度较高,绝大部分处于超螺旋状态,有利于体内转基因的表达.紫外分光光度计测量质粒DNA的含量(A 260/A280)为1.8~2.0.②目的基因hPH-20mRNA体内表达RT-PCR检测:重组质粒组注射后第4天即可检测到1530 bp特异性条带,第7天表达增强,第11天达到高峰,第16天表达下降.空载体组、生理盐水组各时间点均未见特异性条带.结论:脂质体介导基因转染法能够高效将peDNA3.1( )-hPH20 DNA疫苗质粒导入小鼠骨骼肌中,且hPH-20基因于注射后11 d呈峰值表达. 相似文献
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目的 构建人前脑腓肽原基因真核表达载体,将其转入NIH3T3细胞中表达,为晚期癌症的镇痛研究奠定基础.方法 用pCR的方法获得人脑腓肽原基因,构建人前脑腓肽原基因真核表达载体pCDNA3.1(+)-PENK,用脂质体2000包裹转染NIH3T3细胞,G418筛选稳定表达后检测培养液中脑啡肽的含量.结果 pCDNA3.1(+)-PENK真核表达质粒可以在NIH3T3细胞中高表达.结论 pCDNA3.1(+)-pENK可作为肿瘤镇痛基因治疗的实验研究的有力工具. 相似文献
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pcDNA3.1(+)—增强型绿色荧光蛋白在大鼠鞘内注射的表达 总被引:2,自引:1,他引:1
目的:构建重组质粒pcDNA3.1(+)-增强型绿色荧光蛋白(EGFP)并观察其在大鼠体内的转染部位及表达时间.方法:构建重组质粒pcDNA3.1(+)-增强型绿色荧光蛋白后直接注射到正常大鼠的蛛网膜下腔,观察其在大鼠体内转染后的时空效应.结果:双酶切结果符合真核表达载体pcDNA3.1(+)约5.4kb, EGFP约750bp,另外测序分析与文献报道结果完全一致;动物实验结果表明,鞘内注射24h后在大鼠的脑脊膜和脊神经的外膜上有EGFP表达,在14d达到高峰,4周后明显下降,第7周消失;在实验组大鼠的心、肝、脾、肺、肾及股四头肌均没有绿色荧光.对照组所有取材部位均没有绿色荧光.结论: 重组质粒pcDNA3.1(+)-EGFP通过直接注射法被成功转染至大鼠的蛛网膜下腔,且外源基因得到了表达. 相似文献
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目的:了解ABO血型与急性荨麻疹是否存在相关性。方法:选取我院359例急性荨麻疹患者作为病例组,同期体检健康的359例体检者作为对照组,对两组ABO血型分布数据作对比分析。结果:病例组中男169例,女190例,年龄1~67岁,平均27.8岁,其中A型94例(26.18%),B型101例(28.13%),AB型32例(8.91%),O型132例(36.77%)。对比显示病例组患者中O型血的比例明显高于对照组(χ^2=6.11,P<0.05),两组间其他血型比例差异无统计学意义(P值均>0.05)。结论:血型可能与急性荨麻疹存在相关性。相比于其他血型,O型血者可能更易于罹患荨麻疹。 相似文献
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目的探讨氦-氖激光照射对体外培养神经元微管结合蛋(MAP2)表达的影响。 方法采用无血清细胞培养方法,分离并体外培养新生大鼠海马神经元,并以低能量氦-氖激光对其照射,于培养后14d神经元生长旺盛时期取出各组培养皿内盖玻片进行MAP2免疫学组织化学染色,光镜下观察,拍照计数,与其他对照组比较,观察激光照射对神经元微管结合蛋白(MAP2)表达的影响。 结果将氦-氖激光照射组与对照组比较,阳性表达细胞轮廓清晰,照射后阳性表达MAP2的培养神经元数目为(15.85±2.79)个/高倍视野,明显高于对照组[(9.23±2.56)个/高倍视野]的数量,且组间差异有统计学意义(P<0.01)。 结论氦-氖激光照射能促进体外培养新生大鼠海马神经元MAP2的表达。 相似文献
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目的探讨构建hSAMP32DNA疫苗的方法。方法根据GenbankhSAMP32cDNA序列设计引物,RT-PCR得到hSAMP32DNA,将其亚克隆至pGEM-T载体,酶切鉴定后测序;再构建pcDNA3.1(+)-hSAMP32质粒,并对质粒DNA定量。结果(1)人睾丸组织中提取的总RNA显示2条清晰条带,分别对应28S、18S;RT-PCR扩增产物与预期的目的基因hSAMP32长度一致;(2)RT-PCR产物与载体pGEM-T连接后测序,显示其与Genbank的hSAMP32基因序列一致;(3)超螺旋的pcDNA3.1(+)-hSAMP32DNA疫苗不含内毒素。结论应用亚克隆技术构建hSAMP32DNA避孕疫苗的载体pcDNA3.1(+)-hSAMP32,为研制避孕疫苗奠定实验基础。 相似文献
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目的 构建人前脑啡肽原基因真核表达载体,为进一步研究内源性脑啡肽的镇痛活性及相关药物研发奠定基础。方法 取新鲜的人脑颞叶皮质组织,用提取RNA的试剂盒提取总RNA,逆转录成cDNA。设计两对引物,用巢式PCR的方法获得人脑啡肽原基因,并将其插入到克隆载体pMD18-T中,克隆扩增。双酶切真核表达质粒pCDNA3.1(+)及T载体中的目的片段,胶回收重组构建成pCDNA3.1(+)-PENK表达载体。最后限制性酶切鉴定该表达载体。结果 采用巢式RT—PCR技术可以获得人前脑啡肽原基因,经测序证明其碱基序列为编码目的基因的正确序列。凝胶电泳结果证明已将此片段克隆到pCDNA3.1(+)内。结论 成功构建了pCDNA3.1(+)-PENK真核表达质粒。可作为疼痛基因治疗实验研究的有力工具。 相似文献