基于多重PCR的多样本混合检测低频等位基因Di~a和Co~b

目的建立可同时检测低频等位基因Dia和Cob,并且可进行多个样本混合检测的多重PCR基因分型方法。方法针对血型抗原Dia和Cob等位基因的单个核苷酸多态性(SNP)位点分别设计序列特异性引物,建立稳定的多重PCR体系。通过优化引物设计及PCR反应条件,提高多重PCR反应的灵敏度,使其可同时检测5~10份DNA标本。应用     

１ 例血型嵌合体的血清学特点及测序分析

目的 研究血型嵌合体的血清学特征、输血策略及分子生物学确认方法。 方法 采用微柱凝胶法进行 ＡＢＯ 血型鉴定和 不规则抗体筛查。 采用试管法，结合多种手段，进一步进行 ＡＢＯ 血型鉴定。 ＰＣＲ 技术扩增 ＡＢＯ 基因 ７ 个外显子及其邻近内 含子序列后进行测序分析。 结果 患者 ＡＢＯ 正定型与抗 Ａ、抗 Ｂ 试剂反应均呈混合凝集外观，反定型为 ＡＢ 型，不规则抗体 筛查结果阴性；基因测序分析发现患者存在 ３ 条 ＡＢＯ 等位基因，分别为 ＡＢＯ? Ｏ．０１．０２、ＡＢＯ? Ａ１．０２ 和 ＡＢＯ? Ｂ．０１。 结论 患 者为 Ａ 型＋Ｂ 型嵌合体血型，可输注 ＡＢ 型红细胞制品。     

稀有血型抗原基因分型多重PCR体系的构建及应用

<正>1990年以来,大部分血型系统的分子机制都已阐明^[1]。Diego血型系统Di^a/Di^b的等位基因的多态性来自外显子19上C2561T的突变,Di^a等位基因编码854位上的亮氨酸(Leu),而Di^b基因在854位上编码脯氨酸(Pro)^[2-3]。血型系统的这一特征提供了血型抗原检测的分子生物学基础。序列特异性引物聚合酶链式反应(PCR-SSP)已被广泛应用于稀有血型的定型中[4]。本研究建立了同时检测低频等位基因Di^a、Co^b并可进行5份样本混合检测的多重PCR筛选体系。由于5份样本在单一反应管内同时检测,     

人类红细胞血型抗原基因分型多重PCR体系的构建及应用

目的 建立可同时检测血型抗原Dib、k、Jsb1910、Jsb2019的一套稳定的基因分型方法,通过筛选获得所检测人群的稀有血型数据,可扩大中国稀有血型资料库.方法 应用基于PCR的基因定点诱变技术制备Dib、k、Jsb1910、Jsb2019血型等位基因检测对照品.分别针对血型抗原Dib、k、Jsb1910、Jsb2019等位基因的单核苷酸多态性位点设计序列特异性引物,通过优化PCR条件建立多重PCR体系,并对4190份随机献血者样本进行Dib、k、Jsb1910、Jsb2019血型抗原基因分型.结果 成功制备出Dib、k、Jsb1910、Jsb2019基因检测对照品,并成功构建检测血型抗原Dib、k、Jsb1910、Jsb2019的多重PCR体系,所建立的多重PCR体系具有良好的重复性和稳定性,4190份随机献血者样本中共检出2例Di(b-)样本,未检出k-和Js(b-)样本.结论 多重PCR具有快捷、高通量且成本低的优点,可用于筛选稀有血型.获得的稀有血型可存入稀有血型数据库,为稀有血型患者及长期输血患者提供相配合的血液,减少输血不良反应的发生.     

红细胞稀有血型筛选、建库与应用

目的 通过在献血者中筛选稀有血型,获得针对高频血型抗原组表达阴性的稀有表型,解决临床稀有血型血液供应困难的难题.方法 在国家“十一·五”和“十二·五”计划项目中,通过国内13个省级血液中心的联合,利用血型血清学方法和分子生物学方法,我们开展了针对Duffy,Kell,Kidd,MNS,Gerbich,Diego,Yt,Lutheran,Colton,Ok以及ABO,Rh血型系统中高频抗原的筛选.在血清学筛选试验中,采用了适应于高通量的微量板法和改良的抗球蛋白法.这些方法在简化经典的间接抗蛋白试验的同时,又适用于血型自动化检测的需术.在这些血型系统稀有血型筛选中,有10多种稀有血型是通过筛选稀有等位基因的方法来完成的.通过组建多个多重PCR体系,我们成功地完成了针对k,s,Fy(a-),Co(a -),Yt(a-),Di(b-),Kp(c-),Kp(b-),Js(b-),Ok(a-)稀有等位基因的检测.由于单个实验室通常无法同时获各类稀有表型DNA作为分子诊断的实验对照,我们采用了定点诱变技术(SDM),通过环状诱变PCR方法,制备了各种稀有表型等位基因突变点片段,以用于分子生物学方法筛选稀有血型的对照.结果 在2008～ 2010年期间,参于项目的各单位共筛选献血者稀有血型135多万人次.其中北京、上海、广州、天津、武汉、浙江、江苏、成都血液中心筛选汉族献血者130万人次,新疆、内蒙、广西、昆明血液中心筛选少数民族献血者5万多人次.共获得各类稀有血型1000多例.其中包括极为罕见的Ko、Rhnull、Wr(b -)等稀有表型.众多新的血型等位基因和存于中国人群中的特殊遗传模式被发现.同时,也首次在中国人群中发现Yt(a-),Co(a-),Lu(a-b-)等稀有表型.2011年1月,中国稀有血型专业网站开通,通过信息发布、在线查询和BBS论坛讨论,进一步有益于稀有血型的信息交流与技术的推广.在最近2年的临床稀有血型输血应用中,共有＞4000 ml的稀有血液被用于临床抢救与治疗.结论 开展稀有血型筛选并建立全国性的稀有血型信息网络对解决临床稀有血型输注困难是有效的途径.扩大筛选的范围与增加筛选与验证的体系有助于中国稀有血型库的壮大.     

长途运输对机采血小板活化的影响

目的探讨长途运输对机采血小板活化的影响。方法将30例机采血小板分为运输组和对照组,其中运输组进行约8h公路长途运输,分别于d1(运输前)、d2(运输后)、采集后第3天(d3)、采集后第5天(d5)用流式细胞仪检测P-选择素(CD62P)、PAC-1等血小板活化指标。结果机采血小板经运输后随保存时间延长,血小板上CD62P和PAC-1含量逐渐升高。运输组与对照组d2、d3、d5时间点CD62P水平差异均有统计学意义(P均0.05),而PAC-1在d5时间点两组差异有统计学意义(P0.05)。结论长途运输对机采血小板活化有明显影响。     

3例弱D表型献血者的RhD抗原表位和分子机制研究

目的研究3例RhD抗原表型为弱D型54的献血者的RhD抗原表位和分子机制。方法采用常规试剂对3例弱D型54样本进行Rh分型,并采用D-screen分析样本的RhD抗原表位。对RHD基因全部外显子测序并分析RHD基因杂合性。使用Robetta服务器进行模型构建。结果 2例样本仅检出365C>T突变,1例样本检出365C>T杂合突变和1 227G>A杂合突变。经D-screen中全部抗体检测的2例样本表现出与部分D表型中DVII相同的D抗原表位分布,另1例未经D-screen全部抗体检测的样本与DVII的D抗原表位分布类似。同源建模分析显示弱D型54的胞内S122L突变也可能影响D抗原胞外区的蛋白结构。结论首次在中国人中报道了弱D型54,并首次分析了该表型的D抗原表位组成。弱D型54具有部分D表型的特征,可能引起同种免疫。     

S-亚硝基谷胱甘肽抑制血小板凋亡的体外研究

目的探讨一氧化氮(NO)供体S-亚硝基谷胱甘肽(GSNO)对储存期内机采血小板细胞凋亡的影响。方法 6份机采血小板,每份分装到2个血小板保存袋,随机分到实验组和对照组,实验组加入GSNO(终浓度为100μmol/L),对照组加入无菌生理盐水。于(22±2)℃震荡保存,分别于第1、3、5、7天取血小板进行扫描电镜观察,采用流式细胞仪检测血小板凋亡情况,采用蛋白免疫印迹法检测凋亡相关蛋白表达。结果实验组血小板NO含量高于对照组(P0.05)。血小板扫描电镜图显示,实验组血小板显微形态在外形、减少聚集等方面均优于对照组。在血小板保存过程中,乳酸含量不断累积(P0.05),葡萄糖含量不断消耗(P0.05),PS膜外翻的血小板数量不断增加(P0.05);且实验组血小板乳酸、葡萄糖含量和PS膜外翻阳性率均低于对照组(P0.05);凋亡相关蛋白Bax、Bcl-x L和Bak表达水平均未随保存时间延长而发生显著变化(P0.05),两组上述三种蛋白表达水平差异均无统计学意义(P0.05)。结论在血小板保存过程中加入NO供体GSNO,可在一定程度上抑制血小板细胞凋亡,减少血小板贮存损伤。     

基于微流控芯片的实时荧光定量 ＰＣＲ 技术快速检测血小板制剂细菌 污染

摘要：目的 通过微流控芯片检测平台应用 Ｔａｑｍａｎ 探针的实时定量 ＰＣＲ 技术对血小板制剂中的细菌１６Ｓ ｒＤＮＡ 进行检测，探 讨该体系在血小板细菌污染的快速检测的应用。方法 向机采血小板中人为添加一定浓度的金黄色葡萄球菌或铜绿假单胞 菌，模拟成１０２ ～１０８ ＣＦＵ／ ｍＬ 细菌污染的血液标本，经１０倍梯度稀释后进行细菌计数及微流控芯片 ＦＱ ＰＣＲ 检测细菌１６Ｓ ｒＤＮＡ，并 对检测体系进行特异性、检出限和重复性评价。结果 微流控芯片 ＦＱ ＰＣＲ 体系特异性较强，探针和引物对阳性标本均有反 应，与空白对照无反应。对污染血小板的金黄色葡萄球菌，该方法的最低检出限为 ８６５ ＣＦＵ／ ｍＬ，而对铜绿假单胞菌的最低检 出限为 ８８５ ＣＦＵ／ ｍＬ。当金黄色葡萄球菌与铜绿假单胞菌浓度分别达到最低检测限时，空白对照与各细菌组的 Ｃｔ 值之差分别 为 ４．３５±１．０１ 和 ２．０３±０．６１。各浓度菌液提取的 ＤＮＡ 进行微流控芯片 ＦＱ ＰＣＲ 扩增后的 Ｃｔ 值计算重复性指数在 ０．０１２～ ０．０５２ 范围内。结论 微流控芯片 ＦＱ ＰＣＲ 检测平台可特异、有效地检出血小板中的细菌污染，为确保输血安全提供帮助。     

TRALI相关致病因子在输血患者中的表达分析

目的:观察多次输血患者、输血相关性急性肺损伤(TRALI)疑似患者和健康献血者3个队列的TRALI相关致病因子,探讨TRALI的发病机制.方法:选取54例输血患者(多次输血患者27例,TRALI疑似患者27例)的外周血标本,另选36例正常献血者的外周血作为对照.用流式细胞仪检测多形核中性粒细胞(PMN)表面CD11a与...