黄根醇提物体外抗白念珠菌生物膜作用的研究

目的观察黄根醇提取物体外对白色念珠菌生物膜及相关基因的影响。方法 M27-A2测定黄根醇提取物对白色念珠菌的最小抑菌浓度(MIC);XTT法评价黄根醇提取物对白色念珠菌生物膜形成的影响;实时荧光定量RT-PCR(q RT-PCR)检测黄根醇提取物作用后,ALS基因的表达情况。结果黄根醇提取物对白色念珠菌的MIC为8μg/m L;随着浓度的增加,黄根醇提取物对白色念珠菌生物膜的抑制作用增强,呈正相关性;16μg/m L黄根醇提取物对不同生长阶段的白色念珠菌生物膜均有抑制作用,抑制率随生物膜成熟逐渐降低;q RT-PCR结果显示,药物作用后ALS2、ALS3基因表达降低(7.87±0.27比5.15±0.34;6.24±0.51比2.13±0.23,P<0.05),ALS1基因表达无明显变化(6.11±0.14比5.95±0.31,P>0.05)。结论黄根醇提取物对体外白色念珠菌生物膜有较明显的抑制作用,可能通过抑制ALS2、ALS3基因的表达而实现。     

不同方法检测造血干细胞移植受者巨细胞病毒感染的研究

[目的]探讨造血干细胞移植后检测巨细胞病毒(CMV)感染的有效方法。[方法]分别应用酶联免疫吸附试验(ELISA)法、荧光定量PCR(FQ-PCR)、间接免疫荧光法(IFA)检测11名干细胞移植受者,96份标本的血清IgM抗体、血浆DNA负荷量和外周血白细胞PP65抗原。[结果]ELISA、FQ-PCR和IFA的阳性检出率分别为15.63%、34.38%、36.46%。ELISA的阳性检出率明显低于FQ-PCR和IFA法。IFA与FQ-PCR两种检测方法对CMV感染的测定结果具有良好的一致性(kappa值为0.818)。[结论]IFA和FQ-PCR是检测造血干细胞移植受者CMV早期感染较为敏感的指标,具有良好的临床应用价值。     

再生障碍性贫血患者外周血调节性T细胞、γδT细胞表达分析

[目的]探讨再生障碍性贫血(aplastic anemia,AA)的免疫学发病机制.[方法]用流式细胞术检测32例急性再生障碍性贫血(acute aplastic anemia,AAA)、30例慢性再生障碍性贫血(chronic aplasitc anemia,CAA)患者、32例对照人群外周血淋巴细胞亚群、调节性T细胞、γδT细胞的表达.[结果]与对照组相比AAA、CAA组CD3+CD4+T细胞、CD4/CD8、调节性T细胞显著低于对照组,CD3+CD8+T细胞、γδT细胞显著高于对照组;AAA组与CAA组相比,AAA组γδT细胞高于CAA组,差异有统计学意义(p＜0.05).[结论]T淋巴细胞比例失调、调节性T、γδT细胞功能紊乱可能在AA发生、发展过程中发挥重要作用.     

LTB-hpaA融合基因原核表达系统的构建及其产物免疫性鉴定

黏附素 (HpaA)是幽门螺杆菌 (Heli cobacterpylori,Hp)鞭毛鞘膜蛋白 ,几乎存在于所有的Hp菌株表面 ,序列高度保守 ,可作为基因工程疫苗的候选抗原。本文构建了ltB hpaA融合基因原核表达系统pQE32 ltB hpaA E .coliM15 ,并用SDS PAGE、Westernblot和GM1 ELISA分别证实了LTB HpaA重组蛋白 (rLTB hpaA)表达和免疫性。采用常规苯酚 氯仿法分别提取Hp临床菌株Y0 6株和大肠杆菌 4 4 85 1株(中国药品生物制品检定所提供 )DNA。采用PCR扩增hpaA和ltB全基因序列 ,1.5 %溴乙锭预染的琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物。hpaA和ltB基因…     

流式细胞术检测淋巴细胞亚群抗体用量的探讨

目的探讨应用流式细胞术（FCM）检测人淋巴细胞数绝对值在正常范围（0.8～4）&#215;10^9／L时，荧光抗体的最佳用量。方法：取30例标本，淋巴细胞数量在（O.8～4）&#215;10^9／L不等，用流式细胞术检测CD3＋、CD4＋、CD8＋、CD19＋及NK细胞，根据荧光抗体用量分为4组，分别为20、10、5、2．5μL，统计分析4组间差异。结果所测白细胞分化抗原（CD）3＋、CD4＋、CD8＋、CD9＋及自然杀伤细胞（NK），结果4组间差异无统计学意义（P〉0．05）。结论对于淋巴细胞数绝对值在正常范围（O.8～4）&#215;10^9／L的全血标本，减少荧光抗体量至2、5μL对CD3＋、CD4＋、CD8＋、CD19＋及NK细胞检测结果无影响，比常用量可减少8倍，对于临床实验室节约试剂成本、减少浪费等有一定参考价值。     

流式细胞术检测慢性再生障碍性贫血患者T细胞活化的研究

[目的]探讨T细胞活化在再生障碍性贫血(aplastic anemia,AA)发病机制中的作用。[方法]通过流式细胞术检测CD25/CD3~+CD4~+、CD69~+/CD3~+CD4~+、HLA-DR/CD3~+CD4~+、CD25~+/CD3~+CD8~+、CD69~+/CD3~+CD8~+、HLA-DR/CD3~+CD8~+T细胞在慢性AA组患者外周血中的表达水平,并取61例患者为AA组与30例非血液系统疾病对照人群为对照组予比较。[结果]AA组CD25~+/CD3~+CD4~+T细胞比例为8.04%,对照组为6.75%,P<0.05,有统计学意义。AA组HLA-DR/CD3~+CD8~+T细胞比例为15.90%,显著高于对照组6.40%(P<0.01)。[结论]T细胞异常活化可能在再障发病或病情进展过程中发挥重要作用。     

问号钩端螺旋体colA基因产物胶原酶活性及其致病机制研究

目的了解不同问号钩端螺旋体(简称钩体)血清群colA基因分布和序列保守性、表达产物胶原酶活性以及感染细胞时colA基因表达水平变化和产物分泌情况。方法采用PCR及其产物测序法检测我国主要流行的7个问号钩体血清群代表株中colA基因并了解其序列保守性。构建问号钩体黄疸出血群赖型赖株colA基因原核表达系统,Ni-NTA亲和层析法提取表达的目的重组蛋白rColA。采用分光光度法检测rColA水解I~IV型天然胶原蛋白及Azocoll和Pz-肽合成底物能力并测定其Km和Kcat值。采用实时荧光定量RT-PCR和Western Blot分别检测问号钩体赖株感染HUVEC、BEAS-2B、L-02、HEK293细胞时colA-mRNA水平变化及ColA分泌情况。结果不同血清群问号钩体均能扩增出全长colA基因片段,其核苷酸和氨基酸序列相似性高达99.4%~100%。所构建的colA基因表达系统能有效表达rColA。rColA能不同程度地水解上述6种底物,但水解III型胶原蛋白能力最强(P0.05),其Km和Kcat值分别为2.16mg/mL和35.6h-1。问号钩体赖株感染各靶细胞时colA-mRNA水平显著升高(P0.01),问号钩体-细胞共培养物上清中可检出ColA。结论问号钩体colA基因为序列保守、分布广泛的胶原酶编码基因,感染细胞时该基因产物表达上调并外分泌,从而在问号钩体感染宿主过程中发挥实际作用。     

大肠埃希菌临床菌株优势β-内酰胺酶基因型及其诱导表达与抑制的研究

目的 了解浙江地区大肠埃希菌临床菌株优势β-内酰胺酶基因型及其携带模式、β-内酰胺类抗生素诱导β-内酰胺酶基因表达及组氨酸激酶抑制剂氯氰碘柳胺(CLO)抑制其表达的作用。方法 采用微量稀释法和E-test检测大肠埃希菌临床菌株对β-内酰胺类抗生素耐药率和最低抑菌浓度(MIC)。采用PCR及其产物测序法检测大肠埃希菌耐药菌株β-内酰胺酶基因型及携带模式。采用实时荧光定量RT-PCR和β-内酰胺酶确证试验分别检测1/4 MIC头孢噻肟或青霉素及CLO对大肠埃希菌耐药菌株β-内酰胺酶基因转录和表达的影响。结果 浙江地区61.7%(285/462)大肠埃希菌对青霉素、氨苄青霉素、头孢西丁、头孢噻肟和头孢他啶耐药。285株耐药菌株中, TEM和CTX-M基因检出率(83.2%和75.1%)显著高于KPC、SHV和OXA基因(1.4%～10.2%)(P<0.01), 两种以上β-内酰胺酶基因携带率(68.8%)显著高于单基因(31.2%)(P<0.01), 其中61.4%菌株携带TEM+CTX-M基因(P<0.01)。除KPC基因外, 1/4 MIC头孢噻肟和青霉素能诱导89株β-内酰胺酶单基因菌株TEM、CTX-M、SHV和OXA mRNA水平迅速升高(P<0.01), 但可被50～500 μg/ml CLO所抑制(P<0.01)。100 μg/ml CLO预处理后, 82.8%～85.6%耐药菌株对上述抗生素敏感(P<0.01), β-内酰胺酶检出率也从95.1%下降至16.1%(P<0.01)。结论 TEM和CTX-M是浙江地区大肠埃希菌临床菌株优势β-内酰胺酶基因型, 并以TEM-1+CTX-M为优势携带模式。低浓度头孢噻肟和青霉素可经细菌二元信号系统上调β-内酰胺酶基因表达, 但可被组氨酸激酶抑制剂CLO所抑制。     

大肠杆菌不耐热肠毒素B亚单位基因改建及其表达产物粘膜免疫佐剂活性的研究(英文)

目的改建大肠杆菌不耐热肠毒素B亚单位(LTB)基因序列以提高重组LTB(rLTB)原核表达量,确定重组改建LTB(rrLTB)粘膜免疫佐剂活性。方法按大肠杆菌偏爱密码子合成全长LTB基因的核苷酸序列。构建pET32a-rLTB原核重组表达质粒及pET32a-rLTB-E.coliBL21DE3表达系统,提取重组质粒并测定其插入的rLTB基因序列。采用SDS-PAGE和BioRad凝胶成像分析系统鉴定rrLTB表达产量,并与未改建的重组LTB(roLTB)比较。采用GM1-ELISA确定rrLTB和roLTB结合牛GM1的能力。分别以幽门螺杆菌重组尿素酶B亚单位(rUreB),检测rrLTB和roLTB对rUreB对幽门螺杆菌SS1株感染BALB/c小鼠保护作用及产生特异性S-IgA的增强效应。结果pET32a-rLTB-E.coliBL21DE3经1 mmol/LIPTG诱导后,rrLTB表达量约占细菌总蛋白的35.4%,为roLTB(2.8%)的12.6倍。GM1-ELISA结果证实rrLTB和roLTB均能与牛GM1结合。单一rUreB对感染小鼠的免疫保护率为66.7%,但与rrLTB或roLTB合用时,保护率可至91.6%,并可提高感染小鼠特异性S-IgA产生量(P<0.01)。结论改建的LTB基因能明显提高表达量,所表达的rrLTB仍保持较强的粘膜免疫佐剂活性。     

66例血液病患者bcr/abl融合基因、Ph染色体结果分析

CML特异性费城染色体（Philadephia,Ph）是由t（9：22）（q34：11）易位形成。9号染色体原癌基因abl（Abelson protooncogene）易位至22号染色体的断裂点簇集区（breakpoint cluster region,bcr）,发生重排,产生bcr／abl融合基因,引起CML的始动突变。融合基因bcr／abl几乎见于所有的慢性粒细胞性自血病、25％-50％的急性B系淋巴细胞性白血病（ALL）和约5％的急性粒细胞性白血病中,本文统计了进行染色体和ber／abl融合基因检查的初诊血液病66例,对其骨髓细胞染色体核型及bcr／abl融合基因进行分析。