长效重组人干扰素的研究进展

干扰素(interferon,IFN)是机体在细菌或病毒刺激下产生的一类细胞因子,是由单核细胞、淋巴细胞以及体细胞所产生的一类糖蛋白,是机体防御体系重要的组成部分.根据细胞来源和受体的不同,干扰素可分为Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ型.Ⅰ型包括IFN-α和IFN-β,其中IFN-α有二十余个亚型,IFN-β仅有一个亚型,Ⅰ型干扰素具有抗病毒,免疫调节和抗肿瘤等作用.Ⅱ型只有IFN-(γ),且只有一种亚型,除具有抗病毒作用,抗增殖活性外,其主要生物学活性为免疫调节作用.Ⅲ型包括IFN-λ1(IL-29)、IFN-λ2(IL-28A)和IFN-λ3(IL-28B).其中Ⅰ和Ⅱ型干扰素已被批准用于人类疾病的治疗,2003年发现的Ⅲ型干扰素,尚未被批准用于人类疾病的治疗[1].     

基因枪介导的pSilencer-c-Jun载体对大鼠结肠组织的RNA干扰效应

0 引言 RNAi要进入实际应用,迫切需要解决的问题是如何研制有效的给药系统将siRNA分子准确传送到靶组织.基因枪技术已经在肿瘤基因疫苗研制方面得到了应用,关且成功地介导特siRNA抑制肿瘤细胞生长[1].     

孕血清中早孕因子的分离纯化

目的:通过离子交换层析和亲和层析的分离方法从孕血清中得到纯化的早孕因子(EPF),为进一步制备单克隆抗体做准备。方法:采用依次经过DEAE52阴离子交换层析,SP Sepharose F.F阳离子交换层析,Con ASepharose4B亲和层析和Heparin Sepharose Cl6B亲和层析分离纯化方案,最终得到具有早孕因子活性的Hepa-rin-Ⅱ成分,早孕因子活性采用活性玫瑰花环抑制实验检测,采用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定纯化物。结果:SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳显示两条带,相对分子量分别为46.30kDa和10.71kDa。结论:经过四步层析得到较纯的EPF样品,并认为EPF在血清中可以以单体和多聚体形式存在。     

人博卡病毒VP2蛋白单克隆抗体的制备

目的 表达纯化人博卡病毒( human Bocavirus,HBoV) VP2蛋白,采用杂交瘤方法制备抗HBoV VP2蛋白的单克隆抗体.方法 应用原核表达载体pET-30a和大肠埃希菌表达VP2蛋白,并用固定化金属亲和层析,纯化后的蛋白作为抗原免疫BALB/c小鼠,利用杂交瘤技术和间接ELASA方法筛选阳性的杂交瘤细胞,并对单克隆抗体进行分型检测和滴度测定.结果 表达并纯化获得了重组HBoV VP2蛋白,利用杂交瘤技术得到单克隆IgG抗体,抗体效价达到1∶4×105.结论 利用HBoV VP2蛋白免疫制备了单克隆抗体,并具有较高的效价.本研究为快速诊断和研究HBoV打下基础.     

干扰素λ1在CHO细胞中的表达

目的 构建干扰素λ1表达载体PCI-dhfr-λ1和连接增强子SP163的表达载体PCI-dhfr-SP163-λ1,并在CHO(dhfr-)细胞中表达.方法 在合成的干扰素λ1基因中引入相应酶切位点,并通过融合PCR获得连接增强子SP163-λ1基因,测序正确后将该基因插入表达载体PCI-dhfr,构建重组表达载体PCI-dhfr-λ1和PCI-dhfr-SP163-λ1.将所构建的重组表达载体用脂质体法转入CHO(dhfr-)细胞,通过间接免疫荧光法和Western Blot鉴定了λ1蛋白的表达,应用细胞病变抑制法初步鉴定了λ1蛋白的抗病毒活性.结果 成功构建了干扰素λ1真核表达载体PCI-dhff-λ1和PCI-dhfr-SP163-λ1.免疫荧光结果显示分别转染了两种表达载体的CHO(dhfr-)细胞均能表达干扰素λ1蛋白,SP163增强子明显增强了干扰素λ1蛋白的表达,Western Blot结果显示转染SP163的CHO(dhfr-)细胞表达干扰素λ1蛋白.通过细胞病变抑制实验,在转染细胞48h后的细胞培养液中检测到了干扰素λ1的抗病毒活性.结论 本研究成功的在CHO(dhfr-)细胞中表达了干扰素λ1,表达的蛋白具有抗病毒活性,为进一步建立稳定表达干扰素λ1的细胞系提供了条件.     

地塞米松与ATP联用在体外诱导细粒棘球绦虫原头节细胞凋亡的研究

目的 探讨地塞米松与三磷酸腺苷（ATP）联用在体外诱导细粒棘球绦虫原头节细胞凋亡的作用。 方法 体外培养细粒棘球绦虫原头节,分别设地塞米松（5 mmol/L）组、 ATP（1.6 mmol/L）组、 地塞米松（5 mmol/L）+ATP（1.6 mmol/L）组和空白对照组,显微镜下观察原头节变化。药物诱导8 h后,选取原头节形态改变最明显的一组和空白对照组,透射电镜观察这两组原头节的超微结构,原位末端脱氧核糖核苷酸转移酶标记技术（TUNEL法）检测原头节中的凋亡细胞,半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3（caspase-3）活性检测试剂盒检测该酶活性,琼脂糖凝胶电泳检测两组原头节的DNA片段。 结果 药物诱导8 h后观察,与对照组相比,地塞米松组和地塞米松+ATP组的原头节均出现团缩、顶突内凹和体积缩小,钙颗粒明显减少且模糊不清,未见原头节活动,其中地塞米松+ATP组原头节的形态改变更明显,故选择该组作为实验组,与空白对照组进行后续试验。透射电镜观察见实验组原头节中实质细胞体积缩小、细胞膜皱缩、细胞基质浓缩、核异染色质凝集呈团块状或新月形边集于核膜下,表现出凋亡细胞的特征。TUNEL法在实验组的原头节中检测到散在的凋亡细胞,对照组则未见凋亡细胞。实验组caspase-3活性约为对照组的12倍。电泳结果显示,实验组DNA中有约150 bp的核小体DNA片段。 结论 地塞米松与ATP联用可在体外诱导细粒棘球绦虫原头节细胞凋亡。     

人博卡病毒LAMP检测方法的建立及初步应用

目的 建立环介导等温扩增技术（LAMP）检测人博卡病毒（Human bocavirus,HBoV）基因的方法,并用于检测临床样本.方法 通过在线软件设计工具Ptimer Explorer V4设计HBoV NP-1基因的LAMP引物,建立LAMP检测方法,并评价其灵敏度和特异度.结果 与传统PCR方法相比,LAMP法检测灵敏度更高,可达到10拷贝,特异性较强;在76份呼吸道感染儿童的咽拭子标本中检测到5份阳性.结论 建立HBoV LAMP检测方法灵敏特异,简单快速,有望进行临床检测HBoV.     

孕妇血清中早孕因子的分离与纯化

目的：建立一条从妊娠早期妇女血清中分离纯化早孕因子的技术路线，获得高纯度的早孕因子。方法：采用依次经过DEAE 52阴离子交换层析、SP Sepharose F．F阳离子交换层析、ConA Sepharose 4B亲和层析和Heparin Sepharose Cl-6B亲和层析分离纯化的方案，最终得到具有早孕因子活性的Heparin-Ⅱ成分，早孕因子活性采用活性玫瑰花环抑制实验检测。采用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定纯化物。结果：SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳结果显示有一条电泳区带，相对分子量为10．91kDa。结论：这条分离纯化早孕因子的技术路线是可行的，得到的相对分子量为10．91kDa的蛋白质为电泳纯的早孕因子。     

乳腺癌患者外周血中颗粒酶B和穿孔素的表达及意义

目的 分析乳腺癌患者外周血T淋巴细胞及NK细胞中颗粒酶B和穿孔素的表达对乳腺癌的诊断价值，明确颗粒酶B和穿孔素的表达与乳腺癌分子分型、肿瘤分期等临床病理特征的相关性及其对乳腺癌治疗效果的评价。方法 应用流式细胞术检测108例乳腺癌和70例乳腺良性疾病患者样本中CD3⁺T细胞、CD8⁺T细胞及NK细胞中颗粒酶B和穿孔素的表达；采用受试者工作特征(ROC)曲线评估各指标对乳腺癌的诊断效能，比较不同临床病理特征乳腺癌患者颗粒酶B和穿孔素的表达及治疗前后各指标的变化。结果 乳腺癌患者T淋巴细胞亚群与NK细胞中颗粒酶B和穿孔素表达均高于对照组，差异均有统计学意义(P <0.05)。ROC曲线分析结果显示，CD3⁺T细胞、CD8⁺T细胞及NK细胞中颗粒酶B和穿孔素阳性率的曲线下面积(AUC)大于0.5。CD3⁺T细胞中颗粒酶B和穿孔素的表达与乳腺癌肿瘤大小及临床分期呈正相关(P <0.05),CD8⁺T细胞中颗粒酶B也与乳腺癌肿瘤大小及临床分期呈正相关(P...