双碱基缺失型等位基因复合杂合导致的类孟买型个体1例

本研究探索1例类孟买型血型的分子机制,为稀有血型的筛选和鉴定提供理论基础。以血型血清学方法鉴定该个体红细胞的ABO和H表型,利用聚合酶链反应扩增类孟买表型个体的abo基因第6、7外显子和α1,2岩藻糖基转移酶基因(fut1)编码区,并对PCR产物直接测序分析。对纯化的fut1扩增产物进行TOPO克隆和测序,对2处变异位点进行单倍体序列分析。结果表明:血清学分析确认该个体为罕见的类孟买表型;直接测序发现先证者fut1基因第547位和880位附近存在碱基缺失或插入变异;TOPO克隆测序法证实,fut1基因1条单倍体存在第547-552位两碱基AG缺失,另1条单倍体存在880-882位两碱基TT缺失。这2种变异均导致移码突变,并提前形成终止密码。结论:在献血人群中发现1例罕见的类孟买表型,其分子机制为双碱基缺失型fut1等位基因复合杂合所致的α1,2岩藻糖基转移酶活性减弱。     

人血小板表面CD36糖蛋白检测方法的建立及初步应用

个体血小板表面CD36抗原缺乏在随机输注时有产生抗-CD36免疫反应的风险,是血小板输注无效的原因之一。本研究应用流式细胞术检测杭州地区单采血小板供者的血小板表面CD36抗原表达情况,并分析个体血小板上CD36缺失表型的频率。留取献血者新鲜抗凝血样,经离心获取富血小板血浆,洗涤并调整血小板计数至1×106。采用CD36-FITC、CD41-PE单克隆抗体和血小板孵育反应,然后用流式细胞仪检测和分析血小板表面糖蛋白CD36抗原表达情况。对于血小板表面CD36抗原阴性的标本,进一步筛查其单核细胞表面CD36的表达情况。结果表明:192例无偿献血者筛查出7例血小板表面CD36抗原阴性,CD36缺失型频率为3.6%,均为Ⅱ型缺失。人群中个体CD36抗原表达强度存在差异,参照CD36几何平均荧光强度数值大小,59例为低表达,126例为高表达。结论:人群中存在CD36Ⅱ型缺失表型,这些数据将为研究CD36抗原分布提供参考,有助于解决血小板输注无效问题。     

α1,4半乳糖基转移酶基因26个碱基缺失导致的罕见p表型

目的 研究中国人个体P1Pk血型系统中罕见p表型的血清学特征及其分子遗传背景.方法 对1例血清中含有疑难抗体的先证者及其8位家系成员样本,应用特异性血型抗体和谱细胞进行血型血清学鉴定.对p表型相关的α1,4半乳糖基转移酶(α-1,4-galactosyltransferase,A4GALT)编码基因A4GALT编码区及侧翼内含子区进行聚合酶链反应和DNA序列分析,并进一步通过克隆测序法鉴定A4GALT等位基因组合.结果 先证者为罕见的p表型,其血清中含有能与所有非p表型红细胞凝集反应并致其溶血的抗-Tja抗体,其他家系成员为正常的P1或P2表型.DNA直接测序和克隆测序分析发现,先证者的A4GALT基因编码区存在972～997位26 bp纯合缺失,该26 bp缺失可引起多肽链的移码突变,导致变异型α1,4半乳糖基转移酶比野生型多83个氨基酸残基;而其他家系成员在该位点均为缺失杂合子或未缺失.结论 在中国人群中发现因A4GALT基因972～997位26 bp缺失导致的p表型.     

人类血小板抗原全套基因分型方法的建立与应用

目的 建立一种基于DNA扩增和测序分型(PCR sequencing-based typing,PCR-SBT)的人类血小板抗原HPA-1～HPA-16w的基因分型方法.方法 从免疫多态性数据库中下载HPA-1～HPA-16w的全套HPA核酸序列,以Primer Premier 5.0软件设计引物,特异性扩增包含HPA-1a/lb到HPA-16aw/16bw多态性的核酸片段.通过调整引物序列和PCR条件获得单一的特异性扩增产物.PCR产物纯化后直接进行DNA序列分析并确定HPA基因型.通过对2份标准样本的HPA分型验证PCR-SBT方法的准确性;并利用PCR-SBT法对2008年度国际输血协会(ISBT)第14届国际血小板免疫学工作组提供的16份比对样本(包括6个含有基因突变的干扰样本)进行HPA基因分型.结果 设计11对引物扩增和测序16个HPA系统.2份标准样本的HPA基因型分别为HPA:1aa/2aa/3ab/4aa/5ab/6aa/7aa/8aa/9aa/10aa/11aa/12aa/13aa/14aa/15aa/16aa和HPA:1aa/2aa/3aa/4aa/5aa/6aa/7aa/8aa/9aa/10aa/11aa/12aa/13aa/14aa/15as/16an.16份ISBT考核样本的256个HPA基因型结果清晰,其中HPA-1～HPA-6w、HPA-9w和HPA-15共8个系统的128个基因型结果与ISBT参考结果完全一致.结论 建立了HPA-1～HPA-16w的PCR-SBT分型方法,结合高通量的DNA序列分析仪,具有简单、快速和准确的优点,适合于临床HPA全套基因分型,具有良好的应用前景.     

人类血小板同种抗原相关的膜糖蛋白基因多态性研究

目的 探讨人类血小板同种抗原(human platelet alloantigen,HPA)-1～17w相关的血小板膜糖蛋白基因多态性.方法 以自行设计的PCR引物特异性扩增HPA-1～17w相关的血小板膜糖蛋白基因片段,PCR产物经酶切纯化后直接进行DNA序列分析,根据序列特征确定HPA基因型和相应膜糖蛋白基因多态性.结果 通过对112名随机汉族个体的糖蛋白基因序列分析,发现13个新的单核昔酸多态性位点和1个微卫星重复序列.其中ITGB3基因上的2个变异位点1333G/A和1960G/A引起膜糖蛋白GPⅢa的V419M和E628K氨基酸改变.结论 膜糖蛋白基因具有多态性位点,可能引起膜糖蛋白结构的改变,同时可能影响现有部分HPA基因分型方法的准确性.

Abstract：

Objective To investigate the polymorphisms of platelet membrane glycoprotein genes related to human platelet alloantigen (HPA)-1 to 17w. Methods The DNA segments of platelet membrane glycoprotein genes related to HPA-1 to 17w were amplified using author' s designed primers. The amplification products were purified and directly sequenced to identify the HPA genotype and glycoprotein gene polymorphisms. Results Thirteen new single nucleotide polymorphisms (SNPs) and a micro-satellite sequence were found in the glycoprotein genes from the 112 random samples, in which two SNPs (1333G/Aand 1960G/A) in ITGB3 gene result in two amino acid change (V419M and E628K) on glycoprotein GPⅢ a.Conclusion New variants in platelet membrane glycoprotein genes were identified, which may lead to structure change of platelet membrane glycoprotein and affect the accuracy of partial HPA genotyping method.     

10例类孟买表型α1,2岩藻糖基转移酶基因序列分析

目的:分析10例类孟买血型表型的α1,2岩藻糖基转移酶基因序列情况。方法:ABO、H抗原检测采用血清学方法,利用PCR技术扩增FUT1编码区序列,PCR产物双酶切后直接测序分析。杂合子突变标本采用TOPO TA技术分离得到单链。结果:类孟买血型表型红细胞缺乏H抗原,与抗H试剂不凝集。10例标本直接测定FUT1基因编码区序列,3例为第547-552位AG两碱基缺失(CAGAGAG→CAGAG)纯合子,其它7例为有不同突变点的杂合子。单体型分析显示存在235C、293T、547-552delAG、658T、35T+682G、880-882delTT等6种单体型。结论:类孟买血型存在多种分子遗传机制,最常见单体型为547-552delAG。     

新的HLA-B等位基因B*5522的测序分析

人类白细胞抗原(HLA)在造血干细胞移植和器官移植中发挥重要作用.HLA系统是目前所知最具多态性的系统,现已命名的HLA等位基因超过2941个,并且仍不断在发现新的等位基因.本文在检测造血干细胞捐献者样本中发现一例新的HLA-B等位基因,已被世界卫生组织(WHO)HLA命名委员会于2006年4月正式命名为HLA-B*5522,现将结果报告如下.     

α-1,2岩藻糖基转移酶基因35C〉T和682A〉G突变点体外表达的研究

本研究探讨35C〉T和682A〉G突变点对α-1,2岩藻糖基转移酶（FUT1）表达活性的影响。PCR扩增FUT1全长编码序列DNA片段,通过TOPOTA技术连接至表达载体pcDNA3.1/V5-His,获取目的重组质粒。采用脂质体转染方法将重组质粒转染COS-7细胞,经G418筛选培养后,利用流式细胞术分析细胞表面H抗原,实时荧光PCR检测fut1 mRNA表达情况。结果表明：成功获取了35T、682G＋35T和682A＋35C重组质粒。转染2天后H抗原在COS-7细胞膜上表达,第4天达最高峰。与野生型（682A＋35C）转染的细胞相比,第4天重组质粒（682G＋35T）转染细胞H抗原的表达量仅为野生型的13.3%,而重组质粒35T转染细胞为野生型的52.7%。转染后fut1mRNA水平随着时间延长而逐渐递减,在第1天重组质粒（682G＋35T）转染细胞fut1 mRNA水平仅为野生型（682A＋35C）的14%。结论：682A〉G突变明显降低α-1,2岩藻糖基转移酶活性,而35C〉T引起H抗原的表达部分下降。     

1种用于分析疾病相关ABO抗原丢失的染色体杂合性缺失方法

目的 建立1种9号染色体杂合性缺失(LOH)的分析方法,以解释因ABO基因附近染色体的LOH导致的疾病相关ABO抗原丢失现象.方法 在9号染色体长臂和短臂上共选取13个微卫星位点,其中10个位点(D9S1677、D9S289、D9S1776、D9S1682、D9S290、D9S164、D9S1818、D9S1826、D9S158、D9S1838)位于ABO血型基因近端,平均间距5.52 cM;另3个位点(D9S1858、D9S171、D9S1843)位于ABO基因远端,平均间距39.3 cM.分别设计合成FAM和HEX荧光标记引物,优化PCR扩增后,以聚丙烯酰胺凝胶毛细管电泳,通过GeneMapper软件分析微卫星不稳定性,观察染色体LOH发生情况.结果 13个微卫星位点均得到了较好的PCR扩增效果,PCR产物长度在75～273 bp之间,各位点均有较高的杂合度,适合于微卫星片段长度分析.13个位点可在2个泳道中进行双荧光同步分析,各位点不同等位基因间互不干扰.分别对1例正常血型标本和2例血液病相关的ABO抗原变异标本(包括口腔黏膜DNA和外周血DNA)进行微卫星分析,正常血型标本的口腔DNA和外周血DNA未发现染色体LOH现象.而2例ABO抗原变异标本,与口腔黏膜DNA相比,外周血DNA均存在不同程度的LOH现象,表明ABO抗原丢失可能源于血液系统疾病相关的9号染色体LOH现象.结论 建立了1种基于微卫星不稳定分析的9号染色体LOH方法,可用于血液系统疾病相关的ABO抗原丢失标本分子机制的研究.