负性协同刺激分子B7-H4在小鼠树突状细胞上的表达及其生物学意义

目的 探讨B7-H4分子在小鼠树突状细胞分化发育过程中的表达及其在T细胞活化中的作用.方法 采用GM-CSF和IL-4联合方案体外诱导小鼠髓系树突状细胞(DCs);采用流式细胞术检测未成熟DCs、成熟DCs以及IL-10诱导的DCs表面B7-H4分子的表达;采用3H-TdR掺入试验和抗B7-H4单抗(McAb)阻断试验分析DCs表达的B7-H4分子对T淋巴细胞的共刺激效应.结果 经GM-CSF和IL-4联合方案体外诱导的未成熟DCs较高水平表达B7-H4,在IL-10作用下B7-H4表达进一步上调,经TNF-α刺激成熟后,B7-H4的表达显著下调,不同功能状态下DCs表面B7-H4分子均可抑制T细胞的增殖,但以未成熟DCs、IL-10诱导的DCs表面B7-H4分子的抑制作用更为显著.结论 不同功能状态下的DCs均有B7-H4分子的表达,处于抑制状态下的DCs通过高表达B7-H4介导免疫不应答效应.     

抗人CD40人-鼠嵌合抗体在CHO细胞中的表达及其功能研究

目的:实现抗人CD40的人-鼠嵌合抗体(ch-5C11)在的CHO细胞中的稳定表达并对其生物学活性进行初步的研究。方法:pIRES/hu5C11嵌合抗体重组表达质粒用脂质体法转染CHO细胞,采用RT-PCR对CHO细胞进行基因水平鉴定,以流式细胞术(FCM)和Western blot对表达上清中ch-5C11人免疫球蛋白Fc段和κ链成分进行检测,利用Protein G亲和层析和Lowry法进行纯化和定量,MTT实验检测表达ch-5C11对Daudi细胞增殖的抑制效应。结果:获得稳定分泌目的蛋白的CHO稳定株,RT-PCR结果表明目的基因成功整合在CHO稳定株中,FCM和Western blot结果表明稳定株上清中含有抗人CD40抗体,且含人免疫球蛋白Fc段和κ链;Lowry法定量ch-5C11浓度为0.535mg/L,并经SDS-PAGE蛋白电泳鉴定纯度良好;ch-5C11能抑制Daudi细胞增殖。结论:获得了持续分泌ch-5C11的CHO稳定株,功能学研究显示ch-5C11能抑制B细胞淋巴瘤细胞株体外增殖。     

抗人CD40单克隆抗体偶联纳米胶束药物载体系统的构建及其生物学特性

目的：将抗人CD40单克隆抗体5C11与3种含有不同反应基团的聚合胶束（polymeric micelle,PM）偶联,构建相应5C11偶联的聚合胶束（5C11 coupled polymeric micelle,PM-5C11）,筛选出其中最适合与5C11偶联的PM,并观察该偶联物的生物学特性。方法：分别合成3种不同化学结构的聚合物材料,制备相应PM,与5C11偶联后制备PM-5C11,选择其中偶联率和生物安全性均较高的作为最适PM-5C11。将最适PM-5C11与人Burkitt淋巴瘤Daudi细胞株作用,观测其生物学活性及其被Daudi细胞摄取的能力。结果: 成功制备了分别含对甲苯磺酸酯基、丙烯基、羧基的3种PM,其中含对甲苯磺酸酯基和羧基的PM与5C11的偶联率均明显高于含丙烯基的PM的偶联率\[（28.08±2.24）%、（29.06±1.37）% vs （21.26±104）%,P<0.05\];由于含羧基的PM在制备过程中易残留细胞毒性物质,故选取含对甲苯磺酸酯基的PM作为最适PM。相应的最适PM成功偶联5C11形成PM-5C11,最适PM-5C11显示出5C11原有的生物学活性,并且可被Daudi细胞摄取。结论：构建的3种PM中,含对甲苯磺酸酯基的PM在生物安全性、偶联率及相应PM-5C11的生物学活性方面最优,可作为构建纳米药物载体的最佳选择。     

一种高效逆转录病毒载体pSIV-1的构建及其功能的初步鉴定

构建高效的逆转录病毒载体pSIV-1,并对其功能进行初步鉴定。对pEGZ-Term、pLXSN、pGEX-5X-3等各类表达载体的调控元件进行分析后,运用分子生物学手段去除表达载体pEGZ-Term中的部分元件,定向插入启动子SV40、选择性标志G418、多克隆酶切位点等,从而获得一种新型逆转录病毒载体pSIV-1。运用新载体构建含人PD-L1基因片段的重组载体,并用脂质体转染法,将其转染至包装细胞系293T。收集含重组病毒的上清转染L929细胞,用含G418的培养液筛选,成活细胞经流式细胞仪检测到目的蛋白后,扩大培养,从而获得L929/PD-L1基因转染细胞。L929/PD-L1基因转染细胞与活化T细胞体外混合培养,观察PD-L1信号对T细胞活化后表达CD25、CD69的影响。结果,成功构建了pSIV-1逆转录病毒载体;酶切图谱分析与理论值一致;基因转染细胞能持续稳定高表达PD-L1,筛选时间较短,感染效率较高;PD-L1基因转染细胞能显著抑制T细胞的进一步活化。因此构建成一种新型高效逆转录病毒载体pSIV-1,为构建基因转染,并开展相关功能学研究奠定了良好的物质基础。     

PD-L1分子在肺癌细胞株上的表达及其生物学意义

背景与目的目前研究表明,多种人类肿瘤大量表达的PD-L1分子参与了肿瘤免疫逃逸,其机制主要在于肿瘤细胞通过高表达PD-L1分子,与T细胞上的受体PD-1的结合,传递负性调控信号,导致肿瘤抗原特异性T细胞的凋亡和免疫无能。本文着重探讨PD-L1分子在肺癌细胞株上的表达及其对T细胞杀伤效应的调节作用。方法采用常规方法从健康人外周血单个核细胞诱导DCs,并经凋亡肿瘤细胞和激发型CD40单克隆抗体刺激获得成熟DCs,与自体T细胞共育后获得肿瘤特异性CTL细胞;流式细胞术检测肺癌细胞上PD-L1分子的表达;JAM法和单抗阻断实验分析CTL细胞对肺癌细胞株的杀伤效应,ELISA法检测细胞培养上清中IFN-γ的含量。结果经凋亡肿瘤细胞负载的成熟DCs可诱导自体T细胞分化为肿瘤特异性CTL;H1299高表达PD-L1分子(90.3±4.2)%,而A549低表达PD-L1分子(19.4±5.2)%;CTL对A549具有高效特异的杀伤力,而对H1299不能高效杀伤;联合应用PD-L1单抗可促进CTL对H1299的杀伤作用和IFN-γ的分泌(P<0.05)。结论在肺癌细胞株上表达的PD-L1分子,可降低CTL对肺癌细胞的杀伤效应。     

人PD-L1Ig融合蛋白的表达及其生物学活性的研究

为获取人PD L1Ig融合蛋白 ,研究其对T细胞的调节效应 ,采用PCR法从pMD18 T/PD L1中扩增出人PD L1基因的胞外段序列 ,从人脾脏细胞中扩增出人IgG1Fc恒定区基因 ,两者拼接后插入逆转录病毒载体pEGZ Term ,用脂质体法与两个辅助病毒载体共转染 2 93T包装细胞 ,用含病毒颗粒的培养上清反复感染L92 9细胞 ,Zeocin筛选能稳定分泌人PD L1Ig蛋白的基因转染细胞并亚克隆之 ,经无血清培养 ,收集的上清用Dotblot检测、ELISA定量后 ,浓缩并经ProteinG柱纯化 ,再经Westernblot鉴定。以FACS分析纯化蛋白对活化T细胞表达的PD 1结合能力 ,以体外T细胞活化体系观察其对T细胞表型的调节作用。结果表明 ,成功地构建了表达人PD L1Ig蛋白的重组逆转录病毒载体 ;获得的L92 9/PD L1Ig细胞能稳定分泌人PD L1Ig蛋白 ;该蛋白与PD 1受体具有良好的结合能力 ,能抑制T细胞的进一步活化。     

CD40突变体靶向MR分子成像探针制备及体外卵巢癌成像的实验研究

目的 探讨超微超顺磁氧化铁(USPIO)粒子负载的,CD40突变体抗体分子探针的构建方法和其生物、理化性状,以及在体外对卵巢癌的靶向作用.方法 采用化学交联法将单克隆抗体交联于二巯基丁二酸(DMSA)修饰的USPIO,形成具有免疫活性的分子探针,进行磁学性能鉴定.USPIO标记的抗人CD40突变体单克隆抗体5H6(5H6-USPIO)作为实验组,USPIO标记的抗人CD40单克隆抗体5C11(5C11-USPIO)及USPIO为对照组.通过流式细胞术、共聚焦显微镜及普鲁士蓝染色分析其体外生物学特性,采用3.0T MR对探针与高表达CD40突变体卵巢癌(HO8910)进行体外细胞成像.信号变化数据组间比较采用单因素方差分析和LSD检验.采用Cell Counting Kit-8试剂盒检测探针对HO8910细胞的增殖影响.结果 携带USPIO的抗CD40突变体分子探针被成功构建并分离纯化.合成的探针同USPIO相比具有相似的磁学特性和良好的稳定性.流式细胞术、共聚焦显微镜及普鲁士蓝染色证实抗体分子探针能够特异性识别HO8910细胞表面的CD40突变体,对细胞HO8910的增殖无影响.体外MRI显示探针同HO8910细胞结合后T2、T2*值明显缩短,T2图像较对照组明显变暗.5H6-USPIO组的T2、T2*弛豫时间分别为(40.05±1.62)、(3.08±0.11)ms,短于5C11-USPIO[分别为(85.38±4.74)和(11.82±1.00)ms]和USPIO组[分别为(91.62±3.35)和(13.60±1.92)ms],差异均有统计学意义(F值分别为196.29、60.73,P值均＜0.01),而5C11-USPIO、USPIO两组T2、T2*弛豫时间差异无统计学意义(P值均＞0.05).结论 化学交联法可制备出CD40突变体单克隆抗体超顺磁氧化铁粒子探针,该探针具有良好磁学特性及较高生物活性,能够特异性识别卵巢癌细胞HO8910.     

CD40配基化调节小鼠树突状细胞上B7-H3分子表达的研究

目的 探讨CD40配基化对小鼠骨髓来源树突状细胞上B7-H3分子表达的调节作用及其生物学意义。方法 采用GM-CSF和IL-4联合方案体外诱导小鼠髓系DC，并利用mCD40-CHO和TNF-α分别刺激凋亡肿瘤细胞负载的Dc制备成熟DC；采用间接免疫荧光标记法检测成熟Dc上B7-H3分子的表达；RT-PCR检测B7-H3 mRNA转录水平；混合淋巴细胞反应（MLR）和B7-H3单抗阻断实验分析CD40配基化的DC表面B7-H3分子在T细胞活化中的作用；^3H-TdR掺入试验检测DC对T淋巴细胞的促增殖效应；ELISA测定各组MLR反应和DC培养上清中IFN-γ分泌水平。结果 B7-H3分子在DC不同分化发育阶段均有表达，CD40配基化能显著上调凋亡肿瘤细胞负载的DC中B7-H3表达，TNF-α激发的DC弱表达（P〈0．05）；阻断CD40配基化的DC上B7-H3分子能抑制T细胞增殖和IFN-γ分泌；CD40配基化促进凋亡肿瘤细胞负载的DC分泌IFN-γ量也明显高于TNF-α组（P〈0．05）。结论 体外CD0配基化DC的B7-H3分子上调性表达有助于其刺激T细胞增殖和IFN-γ的产生。     

计算机模建和点突变分析抗人CD40单克隆抗体5C11识别的抗原表位

目的:通过计算机模拟与点突变实验初步探讨本课题组前期研制的抗人CD40激发型单克隆抗体5C11识别的抗原表位。方法:利用InsightⅡ软件分别模拟抗原、抗体结构,构建抗原抗体复合物模型,通过计算推测5C11单抗所识别的抗原表位。构建人野生型CD40(wtCD40)及其第70位苏氨酸突变型(70muCD40)和第114位谷氨酸突变型(114muCD40)的重组真核表达载体pIRES2-EGFP/wtCD40、pIRES2-EGFP/70muCD40和pIRES2-EGFP/114muCD40,脂质体转染法将重组载体导入HEK293细胞,筛选稳定转染细胞株(即HEK293/wtCD40、HEK293/70muCD40和HEK293/114muCD40细胞)。流式细胞术和Western blotting检测5C11单抗与HEK293/wtCD40、HEK293/70muCD40和HEK293/114muCD40细胞的结合能力。结果:成功构建pIRES2-EG-FP/wtCD40、pIRES2-EGFP/70muCD40和pIRES2-EGFP/114muCD40真核表达载体和相应稳定转染细胞株。5C11单抗与HEK293/70muCD40和HEK293/114muCD40细胞结合能力较HEK293/wtCD40细胞明显减弱;Western blotting检测结果表明,5C11单抗仅识别HEK293/wtCD40细胞,不识别HEK293/70muCD40和HEK293/114muCD40细胞。结论:人CD40氨基酸序列的第70位苏氨酸和第114位谷氨酸是其单抗5C11识别的抗原表位,对构建人源化CD40抗体具有潜在的临床意义。     

CD40信号和肿瘤免疫

CD40分子是分子量为50 kD的I型跨膜糖蛋白,成熟的CD40分子含有277个氨基酸,属于TNFR超家族成员,表达于APC(antigen presenting cell)、内皮细胞以及某些肿瘤细胞.CD40分子在肿瘤细胞上的表达引起了学者极大的兴趣,研究揭示CD40分子激发不仅可直接作用于肿瘤细胞,其介导的信号还可在多个环节影响肿瘤发生、发展.鉴于此,干预CD40信号可能是肿瘤免疫治疗新的靶点和策略.