DPC4重组腺病毒载体的构建

目的：构建DPC4基因重组腺病毒载体以研究DPC4对胰腺癌的影响。方法：构建PRL-DPC4重组质粒，然后将具CMV启动子的DPC4CDNA片段自PRL-DPC4上切下，亚克隆至腺病毒穿梭质粒中，形成转移质粒PAd△E1-DPC4将这写腺病毒基因组质粒PBHG10共转染293细胞获得重组腺病毒，采用PCR方法对其进行鉴定。结果：在挑选的空斑中有含DPC4CDNA的重组腺病毒，DPC4重组腺病毒可感染293细胞并在293细胞中进行有效的复制。结论：成功构建了DPC4基因重组腺病毒载体，为进一步研究DPC4的功能提供了条件。     

甘露聚糖修饰的靶向纳米脂质体的抗肿瘤作用实验研究

目的研究甘露聚糖修饰的靶向纳米脂质体的抗肿瘤作用。方法用胆固醇氯甲酸醋和N,N-二甲基乙二胺反应生成313[N-（N’,N’-二甲基氨基乙烷）-氨基甲酰]胆固醇（DC—chol）,以DC—chol、二棕榈磷脂酰基乙醇胺（DoPE）和N-[2-（胆固醇氧羰基氨基）乙基]用氨酰甲基化革露聚糖（chol—AECM—mannan）为原料合成甘露聚糖修饰的靶向纳米脂质体,检测脂质体粒径大小。应用C57小鼠制备移植性肺癌模型,静脉给予各种纳米脂质体（实验纳米脂质体,无革露聚糖修饰的包裹有EGFR的纳米脂质体、空纳米脂质体）及对照EGFR,观察小鼠的一般情况及肿瘤生长情况;行ELISA和Western Blotting检测小鼠血清中抗体漓度差别。结果脂质体粒径大小为132．6nm。ELISA和Western Blotting检测均显示实验组小鼠血清有抗体产生而且抗体漓度远大于其他对照组。实验组肿瘤体积明显小于对照组（EGFR及空白脂质体组,P〈0．05）。结论研究结果表明实验组小鼠肿瘤生长受到抑制,甘露聚糖修饰的靶向纳米脂质体对小鼠肺癌有一定疗效。     

MIG(CXCL9)表达载体构建及体外活性鉴定

目的构建MIG（CXCL9）真核表达载体,为利用MIG研究肿瘤基因治疗奠定基础。方法从pBLAST-MIG上切下含MIG全长的cDNA序列,定向插入pORF-mcs真核表达质粒,构建pORF-MIG重组质粒;然后经酶切分析和测序鉴定后,通过脂质体介导转染COS-7细胞;再进一步用免疫印迹法鉴定重组质粒的表达活性,用趋化试验鉴定生物学活性。结果pORF-MIG重组质粒经酶切分析和测序证实含有MIG的全长cDNA序列,转染COS-7细胞后高效表达MIG蛋白,对活化的淋巴细胞有趋化作用。结论成功构建了MIG（CXCL9）真核表达质粒,为进一步利用pORF-MIG研究恶性肿瘤基因治疗奠定基础。     

人EGFR胞外段原核表达及免疫原性研究

目的：研究人EGFR胞外段在原核本质的表达，纯化条件以及对小鼠的免疫原性。方法：以既往构建包含人EGFR胞外段基因的表达质粒为基础，采用基因工程方法构建pET原核表达载体。在大肠杆菌中表达目的蛋白，表达蛋白在变性条件下，通过Ni^2 柱亲和层析纯化以包涵体形式存在的His-Tag融合蛋白，SDS－PAGE检测其纯度。去余His-Tag的纯化蛋白在梯度尿素中透析复性。以复性蛋白免疫小鼠获得抗血清，western blotting及流式细胞仪器检测特异抗体的存在。结论：通过限制酶切分析及测序鉴定表明获得了人EGFR胞外段基因的pET原核表达载体，SDS－PAGE分析表明在IPTG诱导下可以表达90Kd目的蛋白其纯度大于95％，所产生抗体可以识别复性蛋白及表达于A549细胞上的EGFR。提示在大肠杆菌中表达的人EGFR胞外段重组蛋白具有免疫原性，可以进一步用于EGFR免疫研究。     

Smad4对人胰腺癌细胞HS766T生长抑制的研究

目的 探讨Smad4基因在人胰腺癌细胞中的肿瘤抑制作用。方法 应用分子克隆技术构建Smad4真核表达载体，然后用脂质体法将其导入到Smad4同源缺失的人胰腺癌细胞HS766T中，经G418筛选获得可稳定表达Smad4的人胰腺癌细胞克隆，用细胞计数和噻唑蓝(MTT)法观察细胞生长速度及增值率，流式细胞仪(FCM)检测Smad4表达、细胞凋亡及细胞周期情况。结果 获得了Smad4真核表达质粒pcDNA3．1—Smad4。Smad4导人人胰腺癌HS766T细胞后，肿瘤细胞增值能力明显受到抑制、生长速率显著下降，并出现细胞周期G1期阻滞。结论 Smad4基因具有抑制胰腺癌细胞增殖的作用，可作为胰腺癌基因治疗的靶基因。     

反义Cyclin B1提高Lewis肺癌细胞对健择化学敏感性的体内外研究

目的研究CyclinB1反义全长cDNA(AS-CLB1)对小鼠Lewis肺癌细胞(LL/2)化疗敏感性的影响,为将该方法联合健择化疗用于非小细胞肺癌的治疗提供实验依据。方法通过流式细胞术检测LL/2亲本(LP),LL/2空载体(LV)及LL/2/AS-CLB1(LA)细胞的凋亡及细胞周期分布。用健择(20nmol/L～20μmol/L)处理上述三种细胞,分别于1h及24h后用四甲基偶氮唑盐(MTT)比色法评估健择对各组细胞的体外杀伤作用。将上述三种细胞分别接种C57BL/6小鼠,成瘤后用健择〔25～125mg/(kg·d)〕处理各组动物,3d1次,一共4次,观察细胞在体内的成瘤性及动物的生存时间,并用流式细胞仪检测各组动物肿瘤组织的细胞凋亡。结果LA细胞较对照(LP和LV细胞)出现了明显的G1期阻滞及凋亡;健择对LA细胞的体外杀伤作用显著增强;在LA细胞组,细胞的成瘤性明显下降,该组动物肿瘤组织的细胞凋亡明显增加,动物的生存时间也显著延长。结论AS-CLB1可以明显增强LL/2细胞体内外对健择的化学敏感性,其作用可能与AS-CLB1诱导细胞发生G1期阻滞及凋亡,从而增强了健择的抗肿瘤作用有关。     

人骨骼肌TnI-fast基因克隆和体外表达

目的：构建人骨骼肌TnI-fast基因分泌型真核表达载体，为利用TnI-fast基因进行抗肿瘤血管生成基因治疗奠定基础。方法：采用PCR和RT－PCR制备TnI-fast cDNA，构建TnI-fast基因克隆质粒，测序证实后将TnI-fast cDNA插入到pSecTag2B构建分泌型重组真核表达质粒。然后用TnI-fast基因重组表达质粒转染COS－1细胞，检测TnI-fast基因体外表达。结果：DNA测序证实，我们从人骨骼肌总RNA和cDNA文库中扩增的TnI-fas cDNA序列与NCBIGenebank TnI-fast cDNA序列完全一致。ELISA检测证实，TnI-fast/pSec Tag2 B转染后目的基因可在真核细胞中分泌表达。结论：本研究成功地构建了TnI-fast基因重组表达质粒，可进一步用于抗肿瘤血管生成基因治疗动物实验。     

胰腺癌细胞株Pc-3、HS766T DPC4基因的表达检测及其对细胞增殖的影响初探

目的：了解Pc-3、HS766T两个胰腺癌细胞株DPC4基因的表达情况。方法：用Trizol试剂提取两个细胞株培养细胞的总RNA,用RT-PCR的方法合成DPC4的cDNA并经与标准cDNA电泳确认后,用Qiagen PCR纯外试剂盒纯化,将纯化的cDNA与克隆载体P1-Adv连接,并用连接产物转化大肠杆菌,扩增后提取质粒,经酶切鉴定后,送上海博亚公司测序,并上网与基因库中DPC4的cDNA比较,同时观察两个细胞株肿瘤细胞的生长情况。结果：HS766T细胞无DPC4基因表达(同源缺失),Pc-3细胞存在DPC4基因表达,但其cDNA片段与理论值相比．短约200bp,上网BLAST的结果表明,在中间连接区,有一236bp的片段缺失。两个细胞生长观察表明,Pc-3细胞生长明显慢于HS766T。结论：胰腺癌细胞株HS766T中DPC4基因同源缺失,细胞具有生长快速的特点。胰腺癌细胞株Pc-3中有正常功能的DPC4表达．但该DPC4转录产物显示,在其连接区有-236bp的片段缺失。该片段缺失对DPC4功能的具体影响尚不明确。     

载体重靶向与肿瘤基因治疗

病毒载体的靶向性问题是肿瘤基因治疗中的重要研究热点,靶向病毒载体是提高肿瘤基因治疗安全性和有效性的重要途径。载体的靶向策略很多．载体重靶向就是其中重要的一种。本文就近年来在肿瘤基因治疗领域中关于载体重靶向问题的研究进展进行综述,并试图对载体重靶向的途径和研究策略进行归纳和总结。     

表达人CD40配体的重组腺病毒载体的构建

目的　构建含有hCD40L基因的重组腺病毒载体,为其在动物模型体内表达和肿瘤基因治疗提供基础。方法　用XhoⅠ、SwaⅠ双酶切质粒pORF-hCD40L,回收1 900 bp基因片段并定向克隆插入穿梭质粒pShuttle中 XhoⅠ、EcoRⅤ双酶切位点,得到重组质粒pShuttle-hCD40L。经PmeI酶切与腺病毒骨架质粒pAdEasy-1共转化 BJ5183细菌,同源重组后用选择培养基筛选阳性克隆,提取质粒PacI酶切线性化后用脂质体介导转染293细胞。酶切分析和PCR鉴定重组的腺病毒。结果　酶切分析、PCR验证表明,hCD40L基因成功克隆到腺病毒pAdEasy-1 载体中。结论　成功构建表达hCD40L基因的重组腺病毒载体,为进一步研究其在哺乳动物内表达及基因治疗提供了基础。