从包涵体中纯化重组人幽门螺杆菌热休克蛋白A亚单位

目的：建立一种有效从包涵体中纯化重组人幽门螺杆菌热休克蛋白A亚单位HspA的方法。方法：重组基因工程大肠杆菌发酵后，表达的Hp r HspA包涵体经洗涤，变性，复性，采用Q Sepharose High Performance阴离子交换层析和Superdex75凝胶过滤层析分离纯化，使用SDS－PAGE和HPLC检测纯度，选用ELISA和动物实验对纯化蛋白的免疫学活性和生物学活性进行鉴定。结果：Hp的HspA包涵经洗涤和溶解后，Hp的HspA的纯度＞60％，包涵体溶解液经阴离子交换层析和凝胶过滤层析后纯度超过95％，Hp的HspA纯品经检测具有良好的免疫学活性和生物学活性。结论：本研究建立的分离纯化方法可从包涵体中获得高纯度的重组HspA蛋白，为进一步的动物实验研究奠定了基础。     

大肠杆菌不耐热肠毒素B亚单位基因工程菌发酵工艺的研究

目的研究建立大肠杆菌不耐热肠毒素B亚单位(LTB)基因工程菌的发酵工艺.方法先通过摇瓶培养初步确定工程菌的最适生长条件,然后以此为基础在发酵罐中比较、筛选影响菌体生长和目的蛋白表达率的各种条件,并进一步对发酵工艺进行改良优化.结果经试验确定了rLTB基因工程菌发酵罐培养的各项条件的最佳组合,优化后工程菌菌体产量平均可达40.5 g/L,目的蛋白的表达率平均为30.6%.结论建立了稳定、高效的工程菌发酵工艺.     

重组幽门螺杆菌热休克蛋白A亚单位的高效表达及其初步纯化

目的 在大肠杆菌中高效表达幽门螺直菌的热休克蛋白A基因（hspA)，并对其初步纯化。方法 用巢式PCR扩增hspA基因。经测序证实后，克隆于表达载体pIM-1中，转化大肠杆菌。以SDS－PAGE和免疫印迹分析目的蛋白的表达，并测定N－端氨基酸的序列。采用固相镍离子亲和层析，对重组hspA进行初步纯化。结果 扩增的hspA基因为357bp，并在大肠杆菌中得到高效可溶性表达。重组蛋白的表达量最高可达细菌总蛋白的60．5％。免疫印迹及氨基酸测序结果证实，表达产物为幽门螺杆菌hspA亚单位。固相镍离子亲和层析初步纯化的重组HspA的纯度为87．8％，结论 hspA亚单位的高效表达与初步纯化，为批量获得Hp亚单位抗原打下了基础。     

人幽门螺杆菌热休克蛋白A亚单位重组蛋白纯化及免疫活性研究

热休克蛋白 (ｈｅａｔｓｈｏｏｋｐｒｏｔｅｉｎ ,Ｈｓｐ)为幽门螺杆菌 (Ｈｐ)共同的抗原成分 ,分为Ａ(ＨｓｐＡ)、Ｂ(ＨｓｐＢ)两个亚单位。目前 ,通过细菌培养获得大量Ｈｐ,并从中纯化出足量的亚单位抗原非常困难。因此 ,我们采用基因工程技术构建重组ＨｓｐＡ基因工程菌 ,并对ＨｓｐＡ重组蛋白纯化条件及免疫学活性进行研究。试验证明ＨｓｐＡ以包涵体形式表达。采用本室建立的包涵体洗涤、溶解方法进行处理 ,溶解包涵体后ＨｓｐＡ纯度大于6 0 % (Ａ级纯化 )。之后我们采用分步稀释法将ＨｓｐＡ复性。对ＨｓｐＡ的Ｂ级纯化选择ＱＳｅｐｈ…     

人p16基因的重组腺病毒构建及鉴定

目的构建含有人p16基因的重组腺病毒载体,并对其相关指标进行鉴定.方法用基因工程技术将人p16基因cDNA亚克隆至穿梭质粒pAdTrack-CMV上,利用PAdEasy系统进行细菌内同源重组,然后通过脂质体将正确重组体包裹并转染293T细胞,并在其中包装扩增病毒.采用PCR方法对重组腺病毒进行鉴定, 利用穿梭质粒中所带绿色荧光蛋白GFP报告基因,对病毒滴度和感染效率进行检测.结果酶切鉴定及PCR结果证明p16基因重组腺病毒载体构建成功,病毒滴度达6.1×1010pfu/ml,对人成纤维细胞有较强感染能力.结论应用细菌内同源重组方法成功构建了含人p16基因的重组腺病毒载体.     

人IL-24基因重组腺病毒的构建及其在A549细胞中的表达

目的构建含有人IL-24基因的重组腺病毒载体,并转染肺腺癌细胞A549细胞观察其感染能力,为进一步的基因治疗奠定实验基础.方法采用基因工程技术将人IL-24基因cDNA亚克隆至穿梭质粒pAdTrack-CMV上,采用PAdEasy系统进行细菌内同源重组,后通过脂质体将正确重组体包裹并转染293T细胞以包装并扩增病毒.采用PCR方法对重组腺病毒进行鉴定, 利用穿梭质粒中所带绿色荧光蛋白GFP报告基因,对病毒滴度和感染效率进行检定;最后采用免疫组化法对IL-24在A549中的表达进行检测.结果酶切和PCR结果证实IL-24基因重组腺病毒载体构建成功,病毒滴度达1.2×1010 pfu/ml,能够成功转染A549细胞并在其中进行表达.结论成功构建了有较强感染能力的含人IL-24基因的重组腺病毒载体.     

PELA疫苗微球载体的正交优化工艺研究

目的：利用正交设计的数学方法进行实验设计，以牛白蛋白为包裹模型，寻求制备不同疫苗微球载体的最佳条件。方法，采用W／O／W法制备PELA微球，考察不同因素对疫苗微球平均粒径，成球率与蛋白包裹率（三指标）的影响。结果：五因素对疫苗微球成球性影响的主次顺序为PVA浓度＞搅拌速度＞PELA浓度＞油外／外水相体积比＞内水相体积；而对粒径与蛋白包裹率的顺序则为PELA浓度＞PVA浓度＞搅拌速度＞油相／外水相体积比＞内水相体积和PELA浓度＞PVA浓度＞搅拌速度＞内水相体积＞油相／外水相体积比。结论：控制工艺条件，可制备适于不同需求的疫苗微球载体。     

PELA幽门螺杆菌口服疫苗微球黏膜免疫研究

目的：应用复乳挥发法制备PELA泛影葡胺显影微球与缨门螺杆菌超声上清口服疫苗微球，并进行靶向与黏膜免疫研究。方法：采用CT技术，研究显影微球的靶向，PELA幽门曙杆菌超声上清口服疫苗微球口服免疫小鼠后，运用ELISA法检测血清，唾液，肠粘液的抗体改变情况，ELISPOT法分析派伊尔氏结（PP结）抗原特异性抗体形成细胞（ASC）的数量增减，结果；口粒径在10um以下的微球，首先粘附在胃肠黏膜表面，后投递于PP结；H.pylori疫苗微球免疫后可诱导较高的唾液sIgA水平和肠道sIgA反应，PP结抗原特异性抗体形成细胞（ASC）数量与肠道 sIgA水平密切相关，结论：可生物降解的PELA微球可用于靶向口服疫苗的研究。     

液质联用技术鉴定rLTB的结构

目的 利用电喷雾离子化为接口(ESI)的高效液相色谱／质谱联用技术(HPLC-MS),鉴定重组大肠杆菌不耐热肠毒素B亚单位(rLTB)氨基酸序列结构的正确性。方法 利用SDS-PAGE分离、呈现蛋白混合物,胰蛋白酶原位水解rLTB,HPLC-MS联机制备肽指纹图,分析肽指纹图获得rLTB氨基酸全序列信息。结果 rLTB的全序列结构与理论的全序列结构完全一致。结论 改进的HPLC-MS测定条件稳定,提高了质谱灵敏度,结合肽指纹图的分析结果,可以验证蛋白质的氨基酸序列。     

临床检验实习教学的几点体会

临床实习是医学检验专业的学生将所学的理论知识与实践相结合，获得全面发展，最终走向临床一线的必不可少的关键一环。十几年来，我们科室先后承担了军内外从中专到本科多批学生的临床实习教学任务，在带教过程中我们了积极的探索。下面就我们在临床检验学习带教过程中的点滴体会总结如下。