用MDCK细胞为种子细胞体外构建组织工程化肾小管片层的实验研究

目的以MDCK细胞为种子细胞、胶原凝胶复合Matrigel为支架材料,采用组织工程技术体外构建组织工程化肾小管片层,观察不同浓度Matrigel以及静态拉伸作用对MDCK细胞在三维支架中极性重建并形成小管样结构的影响。方法将培养的MDCK细胞与添加不同浓度Matrigel的液态Ⅰ型胶原混合,在12孔板内铸模形成MDCK细胞-胶原片层。通过相差显微镜、HE染色、免疫荧光染色等方法对细胞的生长情况及形成的三维肾小管结构进行比较和鉴定。在此实验的基础上,对片层施加静态拉伸力,观察静态拉伸作用对细胞生长、小管样结构形成的影响。结果随培养时间的延长,各实验组片层内的MDCK细胞逐渐增殖、黏附、聚集。单纯以胶原为支架材料的片层内MDCK形成囊腔状结构;添加Matrigel的胶原片层内MDCK细胞可形成管腔样结构,且低浓度Matrigel的胶原片层内细胞存活率高。静态拉伸作用能够刺激细胞的生长、管腔样结构的形成。结论本研究应用组织工程技术,以MDCK细胞为种子细胞、添加Matrigel的液态Ⅰ型胶原为支架材料,培养过程中施加静态拉伸力,体外成功构建出组织工程化肾小管胶原组织片层,肾脏小管上皮细胞可在该支架材料中完成极性重建的自组装过程。     

细胞密度对组织工程化三维支气管模型体外再造影响的研究

研究种子细胞接种密度对体外构建组织工程化三维支气管模型的影响,并筛选出适宜体外构建支气管模型的细胞密度.以人支气管上皮细胞系和人胎肺成纤维细胞系为种子细胞,胶原凝胶复合Matrigel为支架材料,将两种细胞按照6×104/ml、6×105/ml、6×106/ml和6×107/ml四个接种密度共培养,应用静态拉伸系统体外构建组织工程化三维支气管模型.通过宏观观察、相差显微镜观察和组织学检测的方法对模型中种子细胞的生长情况进行鉴定.结果表明:6×104/ml细胞密度未见到组织片层形成,其余三个细胞密度可以看到收缩良好的组织片层,并具有一定韧性;相差显微镜下观察6×105/ml和6×106/ml细胞密度的组织片层可以形成网状结构,6×107/ml细胞密度的组织片层结构疏松;HE染色证实6×105/ml和6×106/ml细胞密度的组织片层中有三维网状结构形成,免疫组织化学染色广谱CK和Vimentin均呈阳性,前者的细胞活性较后者更好,而6×107/ml细胞密度组织片层基本丧失细胞活性.体外构建组织工程化三维支气管模型其种子细胞密度在6×105/ml至6×106/ml之间较为适宜.     

模拟微重力环境下虫草多糖促进淋巴细胞增殖和CD分子表达的实验研究

本研究旨在探索旋转式细胞培养系统(RCCS)模拟微重力环境下虫草多糖促进淋巴细胞增殖和表面CD分子表达的作用。体外分离培养小鼠脾淋巴细胞,在RCCS模拟微重力环境中分别添加6.25、12.5、25和50μg/ml的虫草多糖溶液培养,在24、48和72 h检测虫草多糖对淋巴细胞增殖及表面CD分子表达的作用。结果表明,模拟微重力环境抑制了淋巴细胞的增殖能力,25和50μg/ml虫草多糖对淋巴细胞的增殖和CD4、CD8的表达均具有促进作用,但50μg/ml虫草多糖促进淋巴细胞增殖的作用随时间延长变为抑制作用。结论:适宜浓度范围内的虫草多糖具有对抗模拟微重力环境下淋巴细胞增殖能力下降和表面CD分子表达减少的作用,为筛选对抗失重效应、促进免疫力的药物提供理论依据和实验基础。     

海藻酸钡-多聚赖氨酸-海藻酸微囊植入大鼠体内的生物相容性的实验研究

研究海藻酸钡-多聚赖氨酸-海藻酸(BPA)微囊在大鼠体内的生物相容性。用静电微囊发生仪制备BPA微囊,将4mL空微囊分别注射于20只Sprague-Dawley大鼠腹腔内,于1、2、4、8周各取5只大鼠,处死后用生理盐水灌洗腹腔,收集灌洗液,待微囊全部沉淀后,计算其中空微囊数并观察微囊的形态改变。结果表明:移植后1、2、4、8周从大鼠腹腔内取出的微囊95%～98%为完整、圆形、表面光滑、无明显的结缔组织包绕。说明我们所制作的BPA微囊具有较好的生物相容性。     

兔子宫内膜中标记滞留细胞的初步鉴定

目的:利用鉴定标记滞留细胞(LRC)的方法分析兔子宫内膜中可能存在的成体干细胞及其分布.方法:首先用促性腺激素处理兔,将子宫内膜调整到增殖期.并采用免疫组织化学方法鉴定增殖期子宫内膜中雌激素受体、孕激素受体、增殖细胞核抗原(PCNA)的表达,以评价子宫内膜的增殖期状态.BrdU标记后追踪8周,以鉴定LRC细胞的存在与分布.结果:增殖期子宫内膜较促性腺激素处理前明显增厚,子宫内膜中雌激素受体、孕激素受体与PCNA的表达明显升高.8周追踪后,子宫内膜中有(2.1±2.4)%的细胞核为BrdU阳性,即LRC细胞.这些LRC细胞主要存在于腔上皮组织中.结论:在成年兔子宫内膜中有LRC存在,子宫内膜成体干细胞可能存在于这些LRC中.     

组织工程化心肌构建研究中形态学检测体系的建立

目的：建立并完善再造工程化心肌组织研究中形态学检测项目平台。方法：取新生大鼠天然心肌组织固定,制作天然心肌石蜡组织切片;用胰酶消化法分离新生大鼠心肌细胞进行细胞爬片培养;以液态胶原为支架材料与来源于新生大鼠的心肌细胞在体外构建工程化心肌组织条带并进行力学拉伸刺激,进而对其进行固定处理,制作石蜡组织切片。之后将天然心肌组织、心肌细胞爬片和工程化心肌组织标本分别进行HE及心肌特异性标志肌钙蛋白T（cTnT）免疫组化染色,并对三者的形态学检测结果进行观察、分析。结果：天然心肌组织的HE及cTnT结果反映了三维立体正常心肌组织在体情况下组织结构、细胞形态、数量比例等组织形态学特点;心肌细胞爬片培养简便直观地反映了体外二维条件下的心肌细胞形态、数量及其比例的改变;工程化心肌组织检测则反映了三维立体再造心肌的组织结构、细胞形态、数量及比例改变。结论：设立天然心肌、心肌细胞爬片及工程化心肌组织三者的HE、cTnT免疫组化检测项目并对其结果进行对照分析,从二维与三维、在体与体外等方面,建立并完善了再造工程化心肌组织研究中形态学检测对照体系,提高了实验效率,节约了实验成本。     

细胞外基质凝胶支架混合人脐静脉来源内皮细胞构建组织工程化的内皮细胞片层

背景：由于血管内皮细胞是形成血管网络的主要功能细胞，因此通过在支架复合体中复合血管内皮细胞的方式促进再造心肌的血管化是目前研究的热点。 目的：以细胞外基质凝胶为支架混合人脐静脉内皮细胞，观察内皮细胞在细胞外基质凝胶中的生长过程及发育情况。 设计、时间及地点：观察实验，于2006-11/2008-01在解放军军事医学科学院基础医学研究所组织工程研究室实验室完成。 材料：取健康剖腹产孕妇的脐带分离培养人脐静脉内皮细胞。取新生SD大鼠鼠尾制备Ⅰ型液态胶原溶液。 方法：将2.4 g/L液态Ⅰ型胶原与2×M199培养基等比例混合，用0.1 mol/L NaOH 调为中性，加入分离培养3 d的人脐静脉内皮细胞，使其终浓度为4×109 L-1，再加入200 g/L的Matrigel基质凝胶。最后加入有静态拉伸力的组织工程化片层所需的模具中，构建组织工程化内皮细胞片层。 主要观察指标：体外培养20 d后光学显微镜、常规苏木精-伊红染色、免疫组织化学染色和透射电镜观察。 结果：显微镜下观察可见内皮细胞在细胞外基质凝胶中形成明显的管腔样、分支样、类似血管样结构。通过组织学和免疫组织化学的检测，证实其确为来源于人脐静脉中分离培养的内皮细胞。电镜观察可见随着时间的延长，在组织工程化内皮细胞片层中，内皮细胞可形成管腔，细胞间有紧密连接。 结论：以细胞外基质凝胶为支架混合人脐静脉内皮细胞构建的组织工程化内皮细胞片层中具有类似血管样结构。     

组织工程化三维支气管模型体外再造的实验研究

目的以人支气管上皮细胞系和人胎肺成纤维细胞系为种子细胞、胶原凝胶复合Matrigel为支架材料,探索采用体外构建组织工程化三维支气管模型的可行性,为研究支气管上皮细胞和成纤维细胞相互作用提供模型。方法将支气管上皮细胞和肺脏成纤维细胞在添加Matrigel的液态Ⅰ型胶原中共培养,应用静态拉伸系统体外构建支气管模型。通过大体观察、相差显微镜观察、HE染色和免疫组织化学染色(广谱CK等)的方法对细胞的生长情况及形成的三维组织结构进行鉴定。结果在体外应用静态拉伸系统能构建出组织工程化三维支气管模型。大体观察可以看到收缩良好的组织片层,并具有一定韧性;相差显微镜下可以观察到网状结构的形成,细胞活性良好;HE染色表明了三维网状结构的形成;免疫组织化学染色广谱CK和Vimentin呈阳性。结论体外成功构建出组织工程化三维支气管模型,种子细胞共培养可在支架材料中完成极性生长过程并形成网状结构。     

细胞外基质凝胶支架混合人脐静脉来源内皮细胞构建组织工程化的内皮细胞片层

背景:由于血管内皮细胞是形成血管网络的主要功能细胞,因此通过在支架复合体中复合血管内皮细胞的方式促进再造心肌的血管化是目前研究的热点。目的:以细胞外基质凝胶为支架混合人脐静脉内皮细胞,观察内皮细胞在细胞外基质凝胶中的生长过程及发育情况。设计、时间及地点:观察实验,于2006-11/2008-01在解放军军事医学科学院基础医学研究所组织工程研究室实验室完成。材料:取健康剖腹产孕妇的脐带分离培养人脐静脉内皮细胞。取新生SD大鼠鼠尾制备Ⅰ型液态胶原溶液。方法:将2.4g/L液态Ⅰ型胶原与2×M199培养基等比例混合,用0.1mol/LNaOH调为中性,加入分离培养3d的人脐静脉内皮细胞,使其终浓度为4×109L-1,再加入200g/L的Matrigel基质凝胶。最后加入有静态拉伸力的组织工程化片层所需的模具中,构建组织工程化内皮细胞片层。主要观察指标:体外培养20d后光学显微镜、常规苏木精-伊红染色、免疫组织化学染色和透射电镜观察。结果:显微镜下观察可见内皮细胞在细胞外基质凝胶中形成明显的管腔样、分支样、类似血管样结构。通过组织学和免疫组织化学的检测,证实其确为来源于人脐静脉中分离培养的内皮细胞。电镜观察可见随着时间的延长,在组织工程化内皮细胞片层中,内皮细胞可形成管腔,细胞间有紧密连接。结论:以细胞外基质凝胶为支架混合人脐静脉内皮细胞构建的组织工程化内皮细胞片层中具有类似血管样结构。     

兔子宫内膜片层体外构建的实验研究

探索以扩增培养的子宫内膜细胞为种子细胞、以液态胶原为支架材料,构建组织工程化子宫内膜片层的可行性。体外分离并规模化扩增子宫内膜上皮细胞与基质细胞,以Ⅰ型液态鼠尾胶原为支架,按自然子宫内膜的结构在体外重建具有两层结构的组织工程化子宫内膜,体外培养14天时进行H.E.染色与免疫组化鉴定。H.E.染色与免疫组化染色结果表明：再造子宫内膜片层在胶原材料中能够较好地维持双层结构,上皮层呈CK18阳性,在某些部位还能够形成极化的柱状上皮。利用体外扩增培养的子宫内膜上皮细胞与基质细胞构建的组织工程化子宫内膜片层具有子宫内膜组织的双层结构与极化上皮特征。